Основы пцр днк технология. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение. применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии

Анализ ПЦР – современный и высокоточный метод диагностики, позволяющий выявлять возбудителя инфекции независимо от стадии патологии. На сегодня этот способ обследования признан наиболее достоверным, так как он исключает получение ложных данных благодаря высокому уровню специфичности.

Суть метода ПЦР

Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция , позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Явление ПЦР было открыто в 20 веке американским ученым Кэри Мюллисом, благодаря которому в разы сократилось время постановки точного диагноза, а следовательно, врачи стали быстрее назначать адекватные терапевтические мероприятия.

Суть анализа ПЦР заключается в многократном увеличении фрагментов ДНК возбудителя, полученного из биологических проб пациента (мочи, крови, слюны и других). Эта методика позволяет увеличить в искусственной среде определенные участки генетического материала при помощи специальных ферментов, к тому же количество исследуемых фрагментов растет до такой степени, что можно их визуально исследовать.

Стоит отметить, что при анализе ПЦР копируются только определенные участки, играющие важную роль в диагностике. Если они присутствуют в организме пациента в ничтожно малом количестве, то этот анализ сможет их выявить.

Методика ПЦР активно используется в медицинской практике для изучения инфекционных и наследственных заболеваний, ведь помимо простого увеличения количества генетического материала (амплификации), он позволяет сращивать отдельные фрагменты ДНК и вводить мутации, осуществляя контроль за генами, которые вызывают опасения.

Что выявляет анализ ПЦР

Анализ ПЦР широко применяется в различных сферах медицины. Конечно, чаще всего он используется в гинекологии и урологии, но методика актуальна и для пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, онкологии и других областей.

Анализ ПЦР позволяет выявить вирусы на различных стадиях заболевания, также он способен выявить скрытые или «спящие» микроорганизмы, которые не вызывают появления клинических признаков:

Вирус папилломы человека разных типов (ВПЧ);
Хламидии;
Трихомонады;
Возбудителя гонореи;
Микоплазмы;
Уреаплазмы;
Гарднереллы;
Грибы кандида;
Микробактерии туберкулеза;
Вирусы гепатита А, В и С;
Хеликобактерии;
Вирусы герпеса;
Цитомегаловирусы (ЦМВ);
Вирусы Эпштейна-Барра.

Преимущества анализа ПЦР

Высокая точность анализа: риск получения ложноотрицательных результатов минимален;
Специфичность методики: анализ ПЦР позволяет выделить конкретный возбудитель инфекции, его вид и тип;
Повышенная чувствительность: анализ ПЦР определяет даже несколько фрагментов ДНК микроорганизма;
Возможность исследования разных биологических сред организма;
Скорость получения результатов: их можно получить через 4-5 часов после процедуры;
Возможность выявления нескольких микроорганизмов из одной пробы биологического материала.

Анализ ПЦР активно используется врачами разных специальностей, при этом отодвигаются на второй план другие методы диагностики. Стоит отметить, что эта процедура позволяет выявить носителей инфекции и латентные формы болезни, при которых нет клинических проявлений, но эти возбудители негативно отражаются на общем состоянии организма и его функциональности, а пациенты представляют опасность для окружающих.

Подготовка и проведение анализа ПЦР

Фрагменты ДНК микроорганизмов находятся в разных биологических средах пациента. Врачи сами определяют области взятия материалов для анализа ПЦР, которые зависят от типа заболевания и его локализации. Если вы обратились к венерологу с целью выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), то будут исследованы выделения из половых органов (мазок или соскоб с шейки матки, влагалища) и мочеиспускательного канала, а также кровь и моча.

Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты.

Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций:

Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться;
В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений;
Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней;
За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек;
Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти;
За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур (сауны, бани и т.п.);
За 2 недели до анализа ПЦР необходимо прекратить прием антибактериальных средств;
За неделю до обследования приостанавливают использование интимных гелей, мазей и вагинальных свечей.

Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными или отрицательными. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.

Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.

Анализ ПЦР во время беременности

Беременность – это особенный период в жизни каждой женщины. В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках (до 12 недель), но иногда назначают и во время 2 триместра.

Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. В большинстве случаев, анализ ПЦР проводят по поводу хламидий, уреаплазм, микоплазм, цитомегаловируса, герпеса и ВПЧ. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов (12 и более).

Не так давно был разработан надежный, высокочувствительный и быстрый метод диагностики различных инфекционных заболеваний человека. Такой способ имеет название «анализ ПЦР». Что это такое, в чем его сущность, какие он может выявить микроорганизмы и как правильно его сдавать, мы расскажем в нашей статье.

История открытия

Также методы ПЦР используются в диагностике онкозаболеваний.

Преимущества метода

Диагностика ПЦР обладает рядом преимуществ:

Высокая чувствительность. Даже при наличии всего нескольких молекул ДНК микроорганизма анализ ПЦР определяет наличие инфекции. Поможет метод при хронических и латентно протекающих заболеваниях. Часто в таких случаях микроорганизм является некультивируемым иными способами.
Для исследования подходит любой материал, например слюна, кровь, половые выделения, волосы, клетки эпителия. Наиболее распространенным является анализ крови и урогенитального мазка на ПЦР.
Не требуется длительного выращивания культур. Автоматизированный процесс проведения диагностики позволяет получить результаты исследования спустя 4-5 часов.
Метод является практически стопроцентно достоверным. Зафиксированы лишь единичные случаи ложноотрицательного результата.
Возможность определить несколько видов возбудителей из одной пробы материала. Это не только ускоряет процесс диагностики заболевания, но и существенно снижает материальные затраты. Часто врач назначает комплексный анализ ПЦР. Цена обследования, состоящего из определения шести возбудителей, составляет около 1500 рублей.

Чтобы результаты были достоверными при проведении исследования ПЦР, сдать анализ нужно, соблюдая рекомендации по предварительной подготовке к диагностике:

Перед сдачей слюны следует воздержаться от приема пищи и лекарств за 4 часа до забора материала. Непосредственно перед процедурой прополощите рот кипяченой водой.
Вышеуказанными правилами нужно руководствоваться и при взятии образца с внутренней поверхности щеки. После полоскания рекомендуют провести легкий массаж кожи для выделения секрета железы.
Мочу обычно собирают в домашних условиях. Для этого нужно провести тщательный туалет половых органов. В стерильный пластиковый контейнер необходимо собрать 50-60 мл мочи. Для обеспечения чистоты материала рекомендуется женщинам вставить тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть кожную складку. Нельзя сдавать материал в период менструальных выделений.
Для сдачи спермы нужно воздержаться от полового акта в течение 3 дней до забора материала. Также врачи советуют отказаться от посещения сауны и принятия горячей ванны, употребления алкоголя и острой пищи. За 3 часа до анализа нужно воздержаться от мочеиспускания.
Для сдачи например если проводится анализ на хламидии ПЦР, как женщинам, так и мужчинам рекомендуется половой покой в течение 3 дней. За 2 недели до анализа нельзя принимать антибактериальные препараты. За неделю нужно прекратить использование интимных гелей, мазей, влагалищных свечей, спринцевание. За 3 часа до исследования нужно воздержаться от мочеиспускания. Во время менструаций забор материала не проводится, лишь спустя 3 дня после прекращения кровяных выделений можно взять урогенитальный мазок.

ПЦР во время беременности

В период ожидания малыша многие инфекционные заболевания, передающиеся половым путем, являются крайне опасными для нормального развития плода. ЗППП могут спровоцировать внутриутробную задержку развития, выкидыш или преждевременные роды, врожденные пороки ребенка. Поэтому крайне важно пройти на ранних сроках беременности обследование методом ПЦР. Сдать анализ необходимо при постановке на учет - до 12 недель.

Забор материала происходит из канала шейки матки с помощью специальной щеточки. Процедура безболезненная и не представляет опасности для малыша. Обычно во время беременности проводят анализ на хламидии ПЦР-методом, а также на уреаплазмоз, микоплазмоз, цитомегаловирус, герпес, папилломавирус. Такой комплекс обследования называют ПЦР-6.

ПЦР для диагностики ВИЧ

В связи с тем, что метод очень чувствителен к изменениям в организме и условиям проведения диагностики, многие факторы могут повлиять на результат. Поэтому анализ ПЦР на ВИЧ-инфекцию не является достоверным методом, его эффективность - 96-98 %. В остальных 2-4 % случаев тест дает ложноположительные результаты.

Но в некоторых ситуациях без ПЦР-диагностики ВИЧ не обойтись. Обычно ее проводят людям с ложноотрицательным результатом ИФА. Такие показатели говорят о том, что у человека еще не выработались антитела к вирусу и их невозможно выявить без многократного увеличения количества. Именно этого можно достичь, проведя анализ крови ПЦР-методом.

Также необходима такая диагностика детям первого года жизни, рожденным от ВИЧ-позитивной матери. Метод является единственным способом достоверного определения статуса ребенка.

ПЦР для диагностики гепатитов

Метод полимеразной цепной реакции позволяет обнаружить ДНК вируса гепатитов А, В, С задолго до образования антител к инфекции или появления симптомов болезни. Особенно эффективным является анализ ПЦР на гепатит С, так как в 85 % случаев такое заболевание протекает бессимптомно и без своевременного лечения переходит в хроническую стадию.

Своевременное обнаружение возбудителя поможет избежать осложнений и длительного лечения.

Комплексное обследование ПЦР

Комплексный анализ ПЦР: обследование методом полимезарной цепной реакции, которое включает в себя определение одновременно нескольких видов инфекций: микоплазмы гениталиум, микоплазмы хоминис, гарднереллы вагиналис, кандиды, трихомонады, цитомегаловируса, герпеса 1-го и 2-го типов, гонореи, папилломавируса. Цена такой диагностики колеблется от 2000 до 3500 руб. в зависимости от клиники, используемых материалов и оборудования, а также от вида анализа: качественного или количественного. Какой необходим в вашем случае - решит врач. В одних случаях достаточно лишь просто определить наличие возбудителя, в других, например при ВИЧ-инфекции, важную роль играет количественный титр. При диагностике всех вышеперечисленных возбудителей обследование называют «анализ ПЦР-12».

Расшифровка результатов анализа

Расшифровка анализа ПЦР не представляет сложности. Есть лишь 2 шкалы показателя - «положительный результат» и «отрицательный результат». При обнаружении возбудителя врачи могут с 99%-й уверенностью подтвердить наличие заболевания и приступить к лечению пациента. При количественном методе определения инфекции в соответствующей графе будет указан числовой показатель обнаруженных бактерий. Только врач может определить степень заболевания и назначить необходимое лечение.

В некоторых случаях, например при определении ВИЧ-инфекции методом ПЦР, при отрицательном результате возникает необходимость проведения дополнительных обследований для подтверждения полученных показателей.

Где сдать анализ?

Где сдать ПЦР-анализ: в государственной поликлинике или в частной лаборатории? К сожалению, в муниципальных медицинских учреждениях аппаратура и методы нередко устаревшие. Поэтому лучше отдать предпочтение частным лабораториям с современным оборудованием и высококвалифицированными кадрами. Кроме того, в частной клинике вы получите результаты значительно быстрее.

В Москве многие частные лаборатории предлагают проведение анализа ПЦР на различные инфекции. Например, в таких клиниках, как «Вита», «Комплексная клиника», «Счастливая семья», «Уро-Про», проводят анализ ПЦР. Цена обследования составляет от 200 руб. за определение одного возбудителя.

Можно сделать вывод, что диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР в большинстве случаев является быстрым и достоверным способом обнаружения возбудителя в организме на ранних сроках инфицирования. Но все же в определенных случаях стоит выбрать другие способы диагностики. Определить необходимость проведения такого исследования может только специалист. Расшифровка анализа ПЦР также требует профессионального подхода. Следуйте рекомендациям врача и не сдавайте самостоятельно анализы, в которых нет необходимости.

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

"Карельская государственная педагогическая академия"

Курсовая работа на тему:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение

Выполнила: студентка Корягина Валерия Александровна

Проверила: Карпикова Наталья Михайловна

Петрозаводск 2013

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.5.4 Эффект "Плато"

1.5.6 Амплификация

Заключение

Введение

Последнее двадцатилетие ознаменовалось широким внедрением в биологические, медицинские и сельскохозяйственные науки молекулярно-генетических методов.

К началу 70-х годов казалось, что молекулярная биология достигла определенной степени завершенности. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам поставил перед исследователями совершенно новые проблемы, которые не могли быть решены с использованием существовавших в то время методов генетического анализа. Прорыв в развитии молекулярной генетики стал возможен благодаря появлению нового экспериментального инструмента - рестрикационных эндонуклеаз. В последующие годы количество методов непосредственного анализа ДНК, основанных на качественно различающихся подходах, начало стремительно увеличиваться.

Современные технологии во многих случаях позволили на более глубоком уровне начать изучение тонкой структурно-функциональной организации ядерных и внеядерных геномов различных организмов. Особое значение это имело для разработки новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. Не менее важным оказалась возможность использования достижения молекулярной генетики в популяционной биологии и в селекции для выявления и анализа генетической изменчивости популяций, сортов и штаммов, идентификации и паспортизации хозяйственно ценных особей, создания генетически модифицированных организмов и для решения других вопросов.

Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Нет универсального метода, который мог бы позволить решить все возникающие проблемы. Поэтому выбор конкретного метода для проводимого исследования является одним из важнейших этапов любой научной работы.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 История открытия Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В 1983 г. К.Б. Мюллис и др. опубликовали и запатентовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которому суждено было оказать глубочайшее влияние на все области исследования и прикладного использования нуклеиновых кислот. Значение этого метода для молекулярной биологии и генетики оказалось столь велико и очевидно, что уже через семь лет автору была присуждена Нобелевская премия по химии.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -полимеразой.

Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании. Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих её направлений.

1.2 Разновидности полимеразной цепной реакции (ПЦР)

·Вложенная ПЦР - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

·Инвертированная ПЦР - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК - рестриктазами <#"justify">полимеразная цепная реакция праймер

·Групп-специфическая ПЦР - ПЦР для родственных <#"center">1.3 Полимеразная цепная реакция

Открытая в середине 80-х годов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов. В ходе каждого цикла реакции из исходной молекулы образуются две копии. Каждая из синтезированных копий ДНК может служить матрицей для синтеза новых копий ДНК в следующем цикле. Таким образом, многократное повторение циклов, приводит к возрастанию количества копий в геометрической прогрессии. Из расчетов следует, что даже при наличии 30 циклов, число копий исходной молекулы составит более 1 миллиарда. Даже если учесть, что в ходе каждого цикла дуплицируются не все ампликоны, то общее количество копий, несмотря на это, составляет достаточно большую цифру.

Каждый цикл полимеразной цепной реакции (ПЦР) состоит из следующих этапов:

·Денатурация - Повышение температуры вызывает раскручивание и расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные;

·Отжиг - Снижение температуры позволяет праймерам присоединиться к комплементарным участкам молекулы ДНК;

·Элонгация - Фермент ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь.

Для амплификации избранного фрагмента используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих определенный участок ДНК. Праймеры ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ДНК-полимераза осуществляет синтез (достройку) взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с праймеров. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Каждая цепь молекулы ДНК, образующаяся с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью другого праймера.

1.4 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразную цепную реакцию проводят в специальных тонкостенных полипропиленовых пробирках, совместимых по размеру с используемым термоциклером (амплификатором) - прибором, который контролирует температурные и временные характеристики этапов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.5 Принцип метода полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий:

1.5.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов

Основными компонентами реакционной (ПЦР) смеси являются: Трис-HCl, KCl, MgCl2, смесь нуклеотидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), праймеры (олигонуклеотиды), препарат анализируемой ДНК, термостабильная ДНК-полимераза. Каждый из компонентов реакционной смеси непосредственно участвует в полимеразной цепной реакции (ПЦР), а концентрация реагентов напрямую влияет на ход амплификации.

·Трис-HCl - определяет pH реакционной смеси, создает буферную емкость. Активность ДНК-полимеразы зависит от pH среды, поэтому значение водородного показателя напрямую влияет на ход полимеразной цепной реакции. Обычно значение pH находится в пределах 8 - 9,5. Высокое значение pH берется из-за того, что при повышении температуры pH Трил-HCl буфера падает.

·KCl - концентрация хлорида калия до 50 мМ влияет на протекание процессов денатурации и отжига, концентрация свыше 50 мМ ингибирует ДНК-полимеразу.

·MgCl2 - поскольку ДНК-полимераза является Mg2+ - зависимым ферментом, то концентрация ионов магния влияет на активность фермента (Mg2+ образует комплексы с НТФ - именно эти комплексы являются субстратом для полимеразы). Высокая концентрация приводит к увеличению неспецифической амплификации, а низкая ведет - к ингибированию реакции, оптимум (для различных полимераз) находится в области 0,5 - 5мМ. Кроме того, концентрация солей магния влияет на протекание процессов денатурации и отжига - повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК (т.е. температуры, при корой 50% двухцепочечных нитей ДНК разъединяются на одноцепочечные).

·НТФ - нуклеотидтрифосфаты являются непосредственными мономерами нуклеиновых кислот. Для предотвращения цепной терминации рекомендуется равноколличественное соотношение всех четырех нуклеотидтрифосфатов. Низкая концентрация данных компонентов в реакционной смеси увеличивает вероятность ошибки при построении комплементарной цепи ДНК.

·Праймеры - Наиболее оптимальным является использование праймеров с разницей температур плавления не более 2 - 4oС. Иногда при длительном хранении при температуре 4oС, или после большого количества замораживаний - оттаиваний праймеры образуют вторичные структуры - димеры, снижая эффективность протекания ПЦР. Устранение данной проблемы сводится к инкубации на водяной бане (Т=95oС) в течение 3 минут и последующему резкому охлаждению до 0oС.

·Препараты ДНК - количество и качество препарата ДНК (матрицы) непосредственно влияет на ход и параметры полимеразной цепной реакции. Избыточное количество образца ДНК ингибирует полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Примеси различных веществ, находящихся в препарате ДНК, могут также уменьшить эффективность протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР): ацетат натрия, хлорид натрия, изопропанол, этанол, гепарин, фенол, мочевина, гемоглобин и др.

·ДНК-полимераза - при использовании малого количества ДНК-полимеразы наблюдается уменьшение синтеза конечного продукта прямо пропорционально размеру фрагментов. Избыток полимеразы в 2 - 4 раза приводит к появлению диффузных спектров, а в 4 - 16 раз - низкомолекулярных неспецифических спектров. Диапазон используемых концентраций - 0,5 - 1,5 единиц активности в перерасчете на 25 мкл ПЦР смеси.

Кроме основных компонентов ПЦР смеси, используют ряд дополнительных веществ, улучшающих качественные и количественные показатели ПЦР: ацетамид (5%) - увеличение растворимости основных компонентов; бетаин (натриевая соль) - стабилизация ДНК-полимеразы, понижение температуры плавления ДНК, выравнивание температуры плавления; альбумин бычий (10-100 мкг/мл) - стабилизация ДНК-полимеразы; диметилсульфоксид (1-10%) - повышение растворимости основных компонентов; формамид (2-10%) - увеличение специфичности отжига; глицерин (15-20%) - увеличение термостабильности фермента, понижение температуры денатурации образца ДНК; сульфат аммония - снижение температуры денатурации и отжига.

1.5.2 Циклический и температурный режим

Общий вид программы полимеразной цепной реакции (ПЦР) следующий:

этап. Длительная первичная денатурация препарата ДНК.1 цикл

этап. Быстрая денатурация препарата ДНК. Отжиг праймеров. Элонгация.30 - 45 циклов.

этап. Длительная элонгация. Охлаждение реакционной смеси.1 цикл.

Каждый элемент этапа - денатурация, отжиг, элонгация - имеет индивидуальные температурные и временные характеристики. Параметры температуры и времени протекания каждого элемента подбирают эмпирически, в соответствии с качественными и количественными показателями продуктов амплификации.

Денатурация. В ходе данного элемента полимеразной цепной реакции происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные. Температурные параметры денатурации находятся в области 90 - 95oС, но в случае ДНК-образца с большим содержанием гуанина и цитозина, температура должна быть увеличена до 98oС. Температура денатурации должна быть достаточной для полной денатурации - расщепления нитей ДНК и избежания "внезапного охлаждения" или быстрого отжига, однако, термостабильная ДНК-полимераза менее устойчива при высоких температурах. Таким образом, подбор оптимальных температурных параметров денатурации для соотношения праймер/образец (препарат ДНК) является важным условием при проведении амплификации. Если температура денатурации на первом этапе выше 95oС, рекомендуется добавлять ДНК-полимеразу в реакционную смесь после первичной денатурации. Продолжительность данного элемента этапа в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) должна быть достаточной для полной денатурации ДНК, но в то же время не оказывать существенного влияния на активность ДНК-полимеразы при данной температуре.

Отжиг. Температура отжига (Та) - один из важнейших параметров полимеразной цепной реакции. Температура отжига для каждого конкретного праймера подбирается индивидуально. Она зависит от длинны и нуклеотидного состава праймера. Обычно она ниже на 2 - 4oС значения температуры плавления (Тm) праймера. Если температура отжига системы ниже оптимальной, то число неспецифических амплифицированных фрагментов возрастает и, наоборот, более высокая температура уменьшает количество амплифицированных продуктов. При этом концентрация специфических ампликонов может резко снижаться, вплоть до ингибирования полимеразной цепной реакции (ПЦР). Увеличение времени отжига также приводит к увеличению количества неспецифических ампликонов.

Элонгация. Обычно каждый вид термостабильной ДНК-полимеразы имеет индивидуальный температурный оптимум активности. Скорость синтеза ферментом комплементарной нити ДНК также является величиной специфичной для каждой полимеразы (в среднем она составляет 30 - 60 нуклеотидов в секунду, или 1 - 2 тыс. оснований в минуту), поэтому время элонгации подбирается в зависимости от типа ДНК-полимеразы и длинны амплифицируемого региона.

1.5.3 Основные принципы подбора праймеров

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3-концам праймеров, т. к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т. к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.

1.5.4 Эффект "Плато"

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом "плато".

Термин эффект плато используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта плато влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато". Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

1.5.5 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

1.5.6 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

1.6 Состав стандартной реакционной ПЦР смеси

х ПЦР буфер (100 мМ р-р Трис-HCl, pH 9,0, 500 мМ р-р KCl, 25 мМ р-р MgCl2) …….2,5 мкл

Вода (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 мкл

Смесь нуклеотидтрифосфатов (дНТФ)

мМ р-р каждого……………………………………….……….0,5 мкл

Праймер 1 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

Праймер 2 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

ДНК-полимераза (5 ед. /мкл) ………………………………………0,2 мкл

Образец ДНК (20 нг/мкл) …………………………………………..1 мкл

1.7 Оценка результатов реакции

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Глава 2: Применение Полимеразной цепной реакции

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых "генетических отпечатков пальцев". Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев.

Установление отцовства

Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. Отец. Ребенок. Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя "генетические отпечатки пальцев" уникальны, родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого - отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром может быть более активен, у другого - менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием.

Клонирование генов

Клонирование генов - это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Метод ПЦР позволил проанализировать наличие последовательностей вирусов папилломы человека в срезах биопсий новообразований шейки матки человека, залитых парафином за 40 лет до данного исследования. Более того, с помощью ПЦР удалось амплифицировать, и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет!

На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на разных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство или выявлять преступника (комплекс HLA представляет собой набор генов главного комплекса гистосовместимости человека; локусы комплекса HLA - наиболее полиморфные из всех известных у высших позвоночных: в пределах вида в каждом локусе существует необычайно большое число разных аллелей - альтернативных форм одного и того же гена).

Используя ПЦР, можно выявлять правильность интеграции чужеродных генетических структур в заранее определенный район генома изучаемых клеток. Суммарная клеточная ДНК отжигается с двумя олигонуклеотидными затравками, одна из которых комплементарна участку хозяйской ДНК вблизи точки встраивания, а другая - последовательности интегрированного фрагмента в антипараллельной цепи ДНК. Полимеразная цепная реакция в случае неизмененной структуры хромосомной ДНК в предполагаемом месте встройки приводит к образованию фрагментов одноцепочечной ДНК неопределенного размера, а в случае запланированной встройки - двухцепочечных фрагментов ДНК известного размера, определяемого расстоянием между местами отжига двух праймеров. Причем степень амплификации анализируемого района генома в первом случае будет находиться в линейной зависимости от количества циклов, а во втором - в экспоненциальной. Экспоненциальное накопление в процессе ПЦР амплифицируемого фрагмента заранее известного размера позволяет визуально наблюдать его после электрофоретического фракционирования препарата ДНК и делать однозначное заключение о встройке чужеродной последовательности в заданный район хромосомной ДНК.

Заключение

Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

Список использованной литературы

1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методы молекулярно - генетического анализа. - Мн.: Юнипол, 2007. - 176 с.

2.ПЦР "в реальном времени"/ Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. - М.: Наука, 2005. - В 2 т

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы и применение 589 стр., 2002 г.

5.Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Сиб. унив. издательствово, 2004. - 496 с.

Под редакцией А.А. Ворбьева "Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии"; Медицинское информационное агентство - 72 стр.

Http://ru. wikipedia.org

Http://scholar. google.ru

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - медицинский журнал

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.

В конце статьи см.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией - разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках - долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Литература

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы - М.: Наука, 2005 - В 2 т. - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Который позволяет обнаружить в биологическом материале малые количества точнее, определенных ее фрагментов, и размножить их во много раз. Затем их идентифицируют визуально путем электрофореза в геле. Реакция была разработана в 1983 г. К. Муллисом и включена в список выдающихся открытий последних лет.

Каковы механизмы ПЦР

Вся методика базируется на способности нуклеиновых кислот к самостоятельной репликации, что в данном случае проводится искусственно в условиях лаборатории. Воспроизведение ДНК может начаться не в любой области молекулы, а только в участках с определенной последовательностью нуклеотидов — стартовых фрагментах. Для того чтобы полимеразная цепная реакция началась, нужны праймеры (или ДНК-зонды). Это короткие фрагменты цепочки ДНК с заданной нуклеотидной последовательностью. Они комплементарные (то есть соответствующие) стартовым участкам

Разумеется, чтобы создать праймеры, ученые должны изучить последовательность нуклеотидов той которая участвует в методике. Именно эти ДНК-зонды обеспечивают специфичность реакции и ее инициацию. не пойдет, если в образце не найдется хотя бы одна молекула искомой ДНК. В целом, для проведения реакции необходимы вышеуказанные праймеры, набор нуклеотидов, термоустойчивая ДНК-полимераза. Последняя является ферментом — катализатором реакции синтеза новых молекул нуклеиновой кислоты на основе образца. Все эти вещества, включая биологический материал, в котором необходимо выявить ДНК, объединяются в реакционную смесь (раствор). Она помещается в специальный термостат, выполняющий ее очень быстрое нагревание и охлаждение за заданное время — цикл. Обычно их 30-50.

Как проходит эта реакция

Сущность ее в том, что во время одного цикла праймеры присоединяются к нужным участкам ДНК, после чего идет ее удвоение под действием фермента. На основе получившихся нитей ДНК в последующих циклах синтезируются новые и новые идентичные фрагменты молекулы.

Полимеразно-цепная реакция идет последовательно, выделяют следующие ее стадии. Первая характеризуется удваиванием количества продукта в течение каждого цикла нагревания и охлаждения. На второй стадии происходит замедление реакции, поскольку фермент повреждается, а также теряет активность. Помимо этого, истощаются запасы нуклеотидов и праймеров. На последней стадии — плато — продукты более не накапливаются, поскольку реактивы закончились.

Где ее применяют

Несомненно, широчайшее применение полимеразная цепная реакция находит в медицине и науке. Ее используют в общей и частной биологии, ветеринарной медицине, фармации и даже экологии. Притом в последней это делают для отслеживания качества продуктов питания и объектов внешней среды. Активно применяется полимеразная цепная реакция в криминалистической практике для подтверждения отцовства и идентификации личности человека. В судебно-медицинской экспертизе, так же, как и в палеонтологии, часто эта методика является единственным выходом, так как обычно для исследования доступно крайне малое количество ДНК. Безусловно, очень широкое применение метод нашел в практической медицине. Он необходим в таких ее областях, как генетика, инфекционные и онкологические заболевания.