Контакт крови с поврежденной сосудистой стенкой или чужеродной поверхностью, замедление и остановка кровотока (стаз) приводят к последовательной активации звеньев гемостаза: адгезии и агрегации тромбоцитов, каскадной активации плазменных белковых факторов, формированию протромбиназы, образованию тромбина, а затем фибринового сгустка, изолирующего поврежденное место и способствующего ускорению регенеративных процессов.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Время свертывания крови - время образования сгустка свежевзятой нестабилизированной венозной крови в стеклянной пробирке.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Специальной подготовки пациента не требуется. Во избежание погрешностей в результатах теста при взятии венозной крови необходимо избегать массажа предплечья, немедленно расслабить жгут после появления крови и выпустить первые ее капли, содержащие фрагменты поврежденных тканей, на ватный/марлевый тампон.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
После обработки спиртом и высушивания области локтевого сгиба в локтевую вену вводят сухую широкую иглу без шприца.
В сухую стеклянную несиликонированную пробирку набирают 1 мл крови, запуская секундомер сразу при ее попадании. Исследование проводят при температуре 20-25 °С. Через 2 мин после взятия крови, а затем каждые 30 с пробирку осторожно наклоняют под углом 45-60° и определяют, растекается ли кровь по стенкам. Секундомер останавливают по завершении образования сгустка (кровь не переливается при наклоне пробирки).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Время свертывания цельной крови при комнатной температуре - 6-11 мин. В связи со значительным влиянием интерферирующих факторов (температуры, состояния стенок пробирки и иглы, частоты и амплитуды наклона пробирки, объема крови и особенностей процедуры ее взятия) разброс результатов теста даже при точном соблюдении условий довольно велик. Тест ориентировочный, для него не существует калибровочных и контрольных материалов.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Возрастание времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах: выраженном дефиците фибриногена и плазменных факторов внутреннего пути гемостаза, действии антикоагулянтов, значительной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и др.
Понижение (менее 4-6 мин) клинически малоинформативно; можно предположить гиперактивацию плазменных факторов или нарушение реологических свойств крови, но чаще укорочение время свертывания крови связано с нарушением техники взятия крови (травматичностью процедуры) или тромбоцитозом. Для дифференцировки требуется проведение скрининговых (оценочных) коагулологических тестов.
Время свертывания крови активированное
Действие каолина при выполнении теста считается аналогичным появлению в кровотоке контактной поверхности - коллагена субэндотелия, искусственных клапанов сердца, протезированных сосудов, магистралей аппаратов для экстра-корпоральных методов лечения и т. д. При этом происходят последовательная каскадная активация плазменных белковых факторов внутреннего пути гемостаза, образование тромбина и формирование фибринового сгустка.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Основная задача при взятии крови - минимальное травмирование тканей, чтобы не спровоцировать высвобождение тканевого фактора.
При взятии капил¬лярной крови желательно пользоваться стандартным ланцетом с круглой иглой, минимально травмирующей ткани при проколе. Во избежание искажения результатов нельзя выдавливать кровь из пальца.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест выполняют на специальных коагулометрах для цельной крови с одноразовыми картриджами, содержащими стандартное количество активатора контактной фазы - каолина. В некоторых картриджах, кроме каолина, содержится инактиватор гепарина, исключающий его влияние на результаты теста. Кровь собирают в картридж прибора с помощью специальной пипетки или капилляра и быстро перемешивают; дальнейшая процедура определения идет автоматически. Момент образования сгустка определяется по изменению сопротивления между электродами, контактирующими с кровью, и образующимся сгустком (электро-метрическое определение) или по затруднению вращения пластикового флажка в кювете (механический коагулометр).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
В большинстве приборов результат колеблется в пределах 80-120 с, зависит от серии картриджей, условий их хранения и использования, количества и свойств каолина, интенсивности и полноты перемешивания крови с каолином, типа регистратора, температуры. В связи со стандартизацией контактной активации свертывания разброс результатов существенно меньший по сравнению с тестом времени свертывания крови.
Для теста нет калибровочных и контрольных материалов (контрольной цельной крови). О качестве анализа можно приближенно судить по результатам исследования венозной или капиллярной крови нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение тестом времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах - дефиците или инактивации плазменных факторов, циркуляции антикоагулянтов, выраженной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, а также возможно при тромбоцитопении. Уменьшение тестом времени свертывания крови активированного может наблюдаться при гиперактивации плазменных факторов, но оно не является основанием для окончательного вывода о состоянии гиперкоагуляции и принятия терапевтических мер (необходимы дополнительные исследования).
В основном определение времени свертывания крови активированного проводят для контроля и регулирования уровня гепаринизации пациента во время работы искусственных органов (аппаратов искусственного кровообращения, искусственной почки, печени, гемосорбции), расчета нейтрализующей дозы протамина сульфата и оценки полноты нейтрализации гепарина. Достоинством метода является возможность исследования непосредственно у постели больного или в операционной (poin of саге - диагностика по месту лечения), а также относительная быстрота выявления больных, резистентных к гепарину, когда для достижения оптимального эффекта приходится вводить повышенные дозы препарата.
Каолиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при 37 °С после стандартной активации контактной фазы каолином (цеолитом) и рекальцификации (восстановления физиологической концентрации ионов Са2+, ранее связанных цитратом при взятии крови). Матрицей для сборки ферментных комплексов коагуляции служат оставшиеся в плазме после центрифугирования тромбоциты паци-ента и фрагменты фосфолипидных мембран, но их недостаточно для полноценного протекания коагуляционных реакций. Именно поэтому тест, помимо коагуляционных факторов, чувствителен к количеству фосфолипидных образований в плазме и их свойствам, а также к присутствию антифосфолипидных антител.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза; накладывают жгут не более чем на 1 мин, используют одноразовые острые иглы достаточного диаметра, расслабляют жгут после появления крови из иглы и выпускают первые капли на ватный тампон. Кровь берут в пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и немедленно перемешивают. Более предпочтительны вакуумные системы для взятия крови, содержащие цитрат; их содержимое перемешивают четырехкратным переворачиванием. Пробирки с цитратной кровью центрифугируют при 1500-2000 g в течение 15 мин и осторожно отбирают супернатант - бедную тромбоцитами плазму. Хранить бедную тромбоцитами плазму до исследования лучше в пластиковых пробирках и непосредственно перед анализом перемешать.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К бедной тромбоцитами плазме добавляют суспензию каолина, прогревают при 37 °С, вносят раствор кальция хлорида и запускают секундомер (или начинают измерение на коагулометре). Определяют время образования фибринового сгустка на коагулометре (предпочтительно) или периодически наклоняя пробирку в водяной бане. Рекомендуют усреднять показатели двух определений одной и той же плазмы.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Результат колеблется в пределах 65-90 с.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты теста сильно влияют условия центрифугирования крови (от них зависит остаточное количество тромбоцитов), а также количество и свойства добавляемого каолина.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Значения каолинового времени свыше 90 с могут свидетельствовать о гипокоагуляции - дефиците плазменных факторов (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, выраженной гемодилюции, циркуляции антикоагулянтов (гепарина и др.) или наличии ингибиторов плазменных факторов и антифосфолипидных антител. Каолиновое время менее 65 с часто бывает связано с нарушением условий центрифугирования или взмучиванием осадка при отборе супернатанта. Кроме того, аналогичные сдвиги возможны при гиперактивации плазменных факторов (в гиперкоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови крови), недостатке естественных антикоагулянтов и др.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест каолинового времени, выполняемый на бедной тромбоцитами плазме, сохранил свое значение лишь при определении волчаночного антикоагулянта; в других случаях желательно выполнение более информативного теста активированного частичного тромбопластинового времени, дающего меньший разброс результатов.
Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при физиологической температуре (37 °С), в условиях стандартной активации контактной фазы, в присутствии фосфолипидов и при добавлении ионов Са2. Заменителем тромбоцитарной фосфолипидной матрицы для сборки коагуляционных ферментных комплексов служат фосфолипиды мозга, эритроцитов или сои, заменителем активационной контактной поверхности - каолин или эллаговая
кислота. Благодаря отсутствию тромбоцитов в плазме и добавлению их заменителя - парциального тромбопластина - на результаты теста практически не влияют тромбоцитарные факторы. Возможно определение активированного частичного тромбопластинового времени на портативных коагулометрах со специализированными картриджами. Иногда тест обозначают как активированное парциальное тромбопластиновое время активированного частичного тромбопластинового времени, что является аналогом активированного частичного тромбопластинового времени.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза (с добавлением цитрата) и получения бедной тромбоцитами плазмы. Параметры активированного частичного тромбопластинового времени стабильны до 4 ч при комнатной температуре; при лечении гепарином исследование необходимо провести в течение 1 ч после взятия материала. Возможно хранение замороженной бедной тромбоцитами плазмы до 10-20 дней, но допустимо лишь однократное размораживание.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 20-45 с. Результаты теста активированного частичного тромбопластинового времени зависят от точности соотношения кровь/цитрат, вида и свойств фосфолипидного компонента и каолина (или эллаговой кислоты), температуры, а также от способа регистрации результатов, типа и чувствительности прибора, вида и активности реагентов, а также от типа оборудования. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои, локальные значения нормы.
Для снижения влияния интерферирующих факторов возможна оценка результата в виде индекса активированного частичного тромбопластинового времени, диапазон нормальных значений которого составляет 0,8-1,2:
Индекс АЧТВ = АЧТВ пациента / АЧТВ контрольной нормальной плазмы.
Возможные варианты контрольной плазмы для расчета индекса активированного частичного тромбопластинового времени:
Смесь плазм не менее чем от 10 здоровых людей, полученных в тех же условиях, что и плазма пациента (это проблематично для небольших лабораторий). Кроме того, обычно не бывает уверенности в том, что эти люди здоровы.
Лиофилизированная референтная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), которую следует разводить за 30 мин до исследования. Лучше, чтобы плазма была заранее протестирована на данном виде прибора и рекомендована производителем оборудования в качестве референтной.
Оптимальный вариант - перекалибровка конкретного типа прибора для определенных видов реагентов и плазм, используемых в лаборатории (так поступают крупные производители лабораторного оборудования). В этом случае для расчетов индекса активированного частичного тромбопластинового времени можно использовать результат измерения аттестованной контрольной плазмы нормального уровня.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста активированного частичного тромбопластинового времени отсутствует, поскольку при определении используют различные реагенты и приборы разной чувствительности. В коагуляционных исследованиях желательно соблюдать рекомендации производителя оборудования для выбора контрольных материалов. Для контроля качества чаще используют свежеразведенную референтную нормальную пулированную плазму, срок годности - 2-4 ч после разведения лиофилизированного препарата) с аттестованным значением активированного частичного тромбопластинового времени. Смешанная бедная тромбоцитами плазма от нескольких здоровых людей (годна в течение 4-6 ч с момента получения) может быть использована для оценки сходимости и воспроизводимости или как вторичный стандарт. Разброс результатов при исследовании одного образца плазмы и использовании реактивов одной серии не дол¬жен превышать 10%.
Нельзя исследовать плазму, имеющую сгустки или следы гемолиза, поскольку из-за активации гемостаза активированного частичного тромбопластинового времени такой пробы может быть уменьшено. При наличии в исследуемой плазме гепарина активированного частичного тромбопластинового времени может значительно удлиняться - до 300 с и более, вплоть до полного несвертывания. Антикоагулянт может попасть в пробу при получении крови из катетера (что крайне нежелательно) или при системном использовании гепарина. В том случае, когда избежать попадания гепарина в пробу невозможно, для исключения эффекта антикоагулянта используют АЧТВ-реагент с инактиватором гепарина либо плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют, сливая ее с осадка.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение активированного частичного тромбопластинового времени может свидетельствовать:
о врожденном или приобретенном снижении количества/активности факторов внутреннего пути гемостаза (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), реже - фактора фон Виллебранда. Снижение факторов IX, X и II возможно, в частности, при лечении непрямыми антикоагулянтами;
об избытке в пробе цитрата - абсолютном (слишком большое количество добавленного цитрата) или относительном (неполное заполнение кровью пробирки со стандартным количеством цитрата);
о наличии в пробе гепарина (при введении пациенту или попадании из катетера) или гирудина;
о наличии в пробе некоторых инфузионных препаратов (декстранов);
о наличии в пробе продуктов деградации фибрина/фибриногена, патологических ингибиторов плазменных факторов или антикоагулянтов волчаночного типа.
Уменьшение активированного частичного тромбопластинового времени клинического значения не имеет, поскольку часто бывает связано с погрешностями взятия и обработки крови. Диагностика гиперкоагуляционных состояний должна основываться на определении маркеров активации гемостаза и оценке конкретной клинической ситуации.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест активированного частичного тромбопластинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы, выявляющий сдвиги внутреннего пути активации свертывания (клиническое значение имеет удлинение активированного частичного тромбопластинового времени). Определение активированного частичного тромбопластинового времени проводят для первичного выявления гипокоагуляционных сдвигов, диагностики гемофилии и мониторинга состояния больных с нарушениями свертывания крови, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, для контроля гепаринотерапии, выявления патологических ингибиторов. При диагностике антифосфолипидного синдрома для определения волчаночного антикоагулянта используют так называемый люпус-чувствительный АЧТВ-реагент со сниженным содержанием фосфолипидов.
Коррекционные пробы по тесту активированного частичного тромбопластинового времени
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси исследуемой плазмы с нормальной донорской плазмой либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам свертывания. Пробы позволяют разграничить причину удлинения активированного частичного тромбопластинового времени - дефицит/дисфункцию факторов свертывания (с определением конкретного недостающего фактора) или наличие ингибиторов свертывания.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Перед выполнением проб необходимо определение активированного частичного тромбопластинового времени исследуемой плазмы; коррекцию проводят лишь при его удлинении. Отдельную порцию тестируемой плазмы смешивают в соотношении по объему 1:1 со свежей нормальной пулированной донорской плазмой или свежеразведенной РНП-плазмой (либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам) и повторяют определение активированного частичного тромбопластинового времени.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты проб может влиять присутствие в тестируемых образцах прямых антикоагулянтов (гепарина и гирудина).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
При наличии в исследуемой пробе ингибиторов свертывания (волчаночного антикоагулянта, ингибиторов факторов VIII и IX) добавка нормальной плазмы не приводит к нормализации активированного частичного тромбопластинового времени. При дефиците факторов в исследуемой плазме недостающие вещества вносят в составе добавки нормальной плазмы, после чего удлиненное активированное частичное тромбопластиновое время становится нормальным. Добавляя субстратную плазму, дефицитную по отдельным факторам, можно определить конкретный недостающий фактор; при добавке плазмы, дефицитной именно по этому фактору, активированное частичное тромбопластиновое время не приходит к норме, в то время как дефицитные плазмы по другим факторам вызывают нормализацию параметра.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
С помощью коррекционных проб по тесту активированного частичного тромбопластинового времени выявляют дефицит факторов внутреннего пути гемостаза и/или наличие их ингибиторов (диагностика врожденной и ингибиторной гемофилии, антифосфолипидного синдрома).
Протромбиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Исследование протромбинового времени представляет важнейший скрининговый тест для оценки системы свертывания крови. Определяют время образования фибринового сгустка в бедной тромбоцитами цитратной плазме при активации внешнего пути гемостаза тканевым тромбопластином, содержащим тканевый фактор и фосфолипиды, в присутствии ионов Са2+ при 37 °С. Источником тромбопластина могут быть эритроциты, ткани мозга или другие ткани; может быть использован и рекомбинантный тромбопластин. Возможно определение протромбинового времени цельной крови на портативных коагулометрах со специальными картриджами.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза. Оптимальным является исследование венозной крови. Капиллярная кровь менее пригодна для определения протромбинового времени, поскольку содержит непредсказуемое количество тканевого фактора, попадающего в нее при проколе пальца, что создает определенные проблемы (в частности, в педиатрии). Капиллярную кровь имеет смысл исследовать при наличии специальных портативных коагулометров, в которых время образования сгустка выражается в пересчете на эквивалент венозной крови и используются картриджи с реагентами, сводящими к минимуму влияние «собственного» тканевого фактора. Кровь из пальца берут непосредственно перед анализом, избегая давления на мягкие ткани; первую каплю удаляют ватным тампоном. Взятую кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, капилляр для взятия предварительно промывают тем же раствором цитрата.
Результаты теста протромбинового времени остаются стабильными до 24-48 ч при хранении венозной крови с цитратом при комнатной температуре в закрытых первичных вакуумных пробирках. При работе с открытыми пробирками требуется отделить плазму от клеток в течение 60 мин и провести определение протромбинового времени в течение 2-4 ч после взятия крови. Полученную плазму до исследования хранят при комнатной температуре; охлаждение до 4 °С более чем на 24 ч может привести к Холодовой активации фактора VII и уменьшению протромбинового времени.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследуемую плазму прогревают до 37 °С, вносят тромбопластиновый реагент с кальция хлоридом и определяют время образования фибринового сгустка (на коагулометре или вручную). При определении протромбинового времени капиллярной крови используют тот же принцип, но применяют реагенты с иной концентрацией действующих веществ, а измерение проводят вручную или на коагулометре с механическим принципом регистрации (желательно в параллельных пробах с вычислением среднего результата).
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ Протромбиновая активность плазмы по Квику
Тест основан на расчетах по калибровочному графику, отражающему зависимость активности протромбинового комплекса (т. е. значения протромбинового времени) от степени разведения нормальной плазмы, выраженной в процентах. Для построения калибровочного графика определяют протромбиновое время неразведенной свежей нормальной пулированной плазмы (100%) и ее 50, 25 и 12,5% разведений. Некоторые исследователи считают нецелесообразным разведение 12,5% из-за снижения содержания фибриногена. Результаты откладывают на координатной сетке и соединяют линией.
При тестировании плазмы пациента измеряют значение протромбинового времени и по калибровочному графику определяют процент протромбина по Квику, отражающий активность факторов протромбинового комплекса в процентах к плазме здоровых людей. Современные коагулометры автоматически рассчитывают этот показатель исходя из результатов определения протромбинового времени в плазме пациента и разведениях контрольной плазмы.
Протромбиновая активность плазмы по Оврену
Кроме теста Квика, при оценке действия непрямых антикоагулянтов возможно исследование плазмы по Оврену. В нем используют реагенты с добавлением адсорбированной бычьей плазмы, содержащей фактор V и фибриноген, что позволяет исключить влияние этих двух компонентов на результаты теста и исследовать активность других факторов протромбинового комплекса (VII, X и II). При этом образцы исследуемых плазм остаются стабильными более длительное время, так как метод оказывается не зависимым от активности термолабильного фактора V.
Расчетные показатели на основе протромбинового времени
Для снижения влияния интерферирующих факторов рекомендуют одновременно определять протромбиновое время исследуемой пробы и референтной нормальной пулированной плазмы, а оценку результата проводить в виде отношений протромбинового времени. Современные коагулометры и анализаторы гемостаза автоматически рассчитывают показатели исходя из результатов определения протромбинового времени в пробе пациента и нормальной плазме.
Протромбиновое отношение: ПО = ПВ пациента / ПВ нормальной плазмы.
Показатель протромбинового отношения имеет прямую логическую связь с изменениями протромбинового времени плазмы пациента (удлинение протромбинового времени влечет за собой увеличение протромбинового отношения). Вместе с тем на результаты определения протромбинового отношения влияет чувствительность конкретного используемого тромбопластина к недостатку факторов внешнего пути (VII, X, V и II), что может привести к несопоставимости данных, полученных с разными партиями реагента.
Прием антикоагулянтов непрямого действия приводит к удлинению протромбинового времени, однако измеренная степень его удлинения существенно колеблется в зависимости от используемого тромбопластинового реагента. В связи с этим Комитет по стандартизации в гематологии ВОЗ в 1983 г. принял стандартизированный показатель - международное нормализованное отношение, который рассчитывают при контроле лечения непрямыми антикоагулянтами (когда недопустимы колебания показателей протромбинового теста в зависимости от применяемых реагентов). Международное номализованное отношение вычисляют исходя из протромбинового отношения и международного индекса чувствительности используемого тромбопластина к нехватке факторов протромбинового комплекса: МНО = ПОмич.
Международный индекс чувствительности для каждой серии реагента обозначается на его упаковке и обычно составляет от 1,0 до 1,6 (более низкое значение предпочтительнее). При использовании тромбопластина, не аттестованного по международному индексу чувствительности, расчет международного нормализованного отношения невозможен; в этом случае определяют протромбиновую активность по Квику.
При определении междунарожного нормализованного отношения в пробе капиллярной крови вследствие влияния форменных элементов крови результат получается менее надежным по сравнению с анализом плазмы, поэтому без использования специальных портативных коагулометров выполнять это исследование не рекомендуют.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Протромбированное время=10-20 с (зависит от типа реагента и условий определения). Доля протромбина по Квику составляет 60-130% (зависит от препарата тромбопластина); некоторые производители указывают только нижнюю границу нормы (например, более 70%), подчеркивая, что уменьшение протромбинового времени и повышение процента протромбина клинического значения не имеют.
Протромбиновое отношение=0,85~1,2. Референтные значения для междурародного нормализованного отношения указывать некорректно, так как этот показатель должен исследоваться у больных, принимающих антикоагулянты непрямого действия; терапевтический интервал международного нормализованного отношения выбирают в зависимости от показаний к назначению препаратов.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Результаты теста протромбинового времени зависят от объема взятой крови по отношению к количеству цитрата в пробирке, активности препарата тромбопластина и его чувствительности к недостатку факторов VII, X, V и II, а также от температуры. При наличии гепарина в исследуемом образце протромбиновое время может значительно удлиняться - до 40 с и более; для исключения такого влияния плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
В тесте Квика калибровочный график строят для каждой новой серии исследований (на одни сутки) и каждой новой серии тромбопластинового реагента. Для обеспечения корректности результатов во всех случаях используют только свежую пулированную плазму от здоровых доноров или свежеразведенную нормальную плазму, для контроля качества - РНП-плазму. Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста протромбинового времени отсутствует, поскольку используют различные реагенты и приборы разной чувствительности, однако производители, как правило, предлагают контрольные плазмы для конкретных условий (реагенты/оборудование). Для оценки воспроизводимости и сходимости может быть использована свежая смешанная плазма от нескольких здоровых доноров (не менее 10) или свежеразведенная лиофилизированная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), срок их годности - 2-4 ч с момента получения или 2 ч после разведения лиофилизированного препарата соответственно. Для повышения точности рекомендуют проводить определение на коагулометре; при исследовании параллельных проб разброс результатов протромбинового времени не должен превышать 1 с.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение протромбинового времени или снижение процента протромбина по Квику может быть связано с врожденным (редко) или приобретенным снижением активности либо дефицитом факторов внешнего пути активации свертывания или (реже) наличием их ингибиторов. Это возможно при заболеваниях печени, коагулопатиях потребления и потерях факторов, дефиците витамина К, приеме некоторых лекарственных препаратов (особенно антагонистов витамина К). При достаточном содержании факторов удлинение протромбинового времени возможно при снижении содержания фибриногена менее 1,5-1,0 г/л, а также под действием прямых антикоагулянтов, но в последнем случае тест протромбинового времени менее чувствителен по сравнению с активированным частичным тромбопластиновым временем.
Уменьшение протромбинового времени или возрастание процента протромбина по Квику не имеют клинического значения, хотя и способны отражать гиперактивность факторов внешнего пути (в том числе при нарушениях процедуры взятия крови).
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест протромбинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы и цельной крови. Определение протромбинового времени используют для контроля лечения антикоагулянтами непрямого действия, выявления изменений количества и активности факторов протромбинового комплекса (VII, X, V и II) и оценки белоксинтезирующей функции печени. Значительное возрастание протромбинового времени часто связано с риском кровотечений.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СКРИНИНГОВЫХ КОАГУЛЯЦИОННЫХ ТЕСТОВ
Изолированное удлинение активированного частичного тромбопластинового времени:
в согетании с кровотогивостью - недостаточность/дефект факторов VIII, IX, XI;
при отсутствии кровотогивости - недостаточность/дефект факторов XII, XI, высокомолекулярного кининогена, присутствие волчаночного антикоагулянта.
Изолированное удлинение протромбинового времени;
недостаточность/дефект фактора VII (редкое состояние).
Сочетанное удлинение удлинение активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени;
действие лекарств - антикоагулянтов, варфарина, массивных трансфузий;
патологигеские состояния - активированное частичное тромбопластиновое время крови, патология печени, дефицит витамина К;
редко встрегаемые состояния - дисфибриногенемии, недостаточность/ дефект факторов X, V, II.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка при добавлении стан-дартного раствора тромбина к исследуемой цитратной плазме при 37 °С. При этом время реакции зависит в основном от концентрации и свойств фибриногена, а также наличия и действия антитромбинов.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К исследуемой бедной тромбоцитами плазме при 37 °С добавляют раствор тромбина и определяют время образования фибринового сгустка (автоматически или вручную). Параллельно тестируют нормальную плазму.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 14-17 с (в зависимости от активности тромбина).
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
При наличии гепарина в исследуемой плазме тромбиновое время может увеличиваться до 120 с и более. Если необходимо исключить эффект антикоагулянта, плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, центрифугируют и исследуют супернатант.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют РНП-плазму; коэффициент вариации значений тромбинового времени обычно не превышает 5%. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои референтные значения (с учетом конкретных условий).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение тромбинового времени может быть вызвано присутствием в крови прямых антикоагулянтов, парапротеинов, гипофибриногенемией, дисфибриногенемией (качественный дефект фибриногена) или накоплением в крови продуктов деградации фибрина и фибриногена, которые обладают антитромбиновой активностью и препятствуют полимеризации мономеров фибрина.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тромбиновое время - один из базовых методов исследования коагуляционных параметров плазмы. Тест проводят для выявления нарушений на этапе превращения фибриногена в фибрин, зависящем в основном от количества фибриногена и ингибиторов фибринообразования - гепарина др. Значительное удлинение тромбинового времени свидетельствует о риске развития кровотечений. Рептилазное время (батроксобиновое, анцистроновое)
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка в цитратной плазме под действием тромбиноподобного ферментного препарата змеиного яда - батроксобина или анцистрона, напрямую отщепляющего фибринопептид А от фибриногена и образующего активные фибрин-мономеры, которые в ходе полимеризации формируют сгусток. Тест нечувствителен к гепарину и его комплексу с антитромбином.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К плазме добавляют один из указанных препаратов змеиного яда, содержащих ферменты прямого фибринообразования. Определение проводят аналогично тесту тромбинового времени; сравнивают время свертывания исследуемой и нормальной плазмы.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рептилазное время уменьшается при гиперфибриногенемии и удлиняется при снижении фибриногена и некоторых дисфибриногенемиях, а также при гиперфибринолизе и наличии в кровотоке большого количества продуктов деградации фибрина, затрудняющих полимеризацию фибрин-мономеров. Тест можно проводить в присутствии гепарина. На результаты не влияют антитела к факторам свертывания и волчаночному антикоагулянту.
Фибриноген (концентрация)
Фибриноген - основа для образования фибриновых сгустков - синтезируется в печени и постоянно присутствует в плазме. От его молекул под действием тромбина отщепляются фибринопептиды и образуются фибрин-мономеры, которые затем самопроизвольно полимеризуются и перекрестно «сшиваются».
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Хронометрический метод предполагает определение времени образования фибринового сгустка при добавлении избытка высокоактивного тромбина к разведенной в 10 раз плазме (для снижения влияния антитромбиновых компонентов) при 37 °С. В этих условиях время реакции зависит в основном от концентрации фибриногена, которая определяется по калибровочному графику. Реже применяемый турбидиметрический кинетический метод сводится к двух-точечному определению скорости нарастания мутности среды при образовании фибрина после добавления к разведенной плазме тромбопластин-кальциевого реагента или препарата змеиного яда.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. При взятии капиллярной крови ее сразу перемешивают в пропорции 1:1 с антикоагулянтом. Материал для исследования стабилен в течение 8 ч при хранении в закрытой пластиковой или силиконированной стеклянной пробирке. Во избежание возможного искажения результатов нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки, следы гемолиза, а также полученную более чем за 8 ч до анализа.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Хронометрический метод требует предварительного построения калибровочного графика путем разведения стандартной нормальной плазмы буферным раствором для получения калибровочных проб, эквивалентных плазме с содержанием фибриногена от 1 до 6 г/л. Исследование проводят на коагулометре при 37 °С; к калибровочным пробам и разведенной буферным раствором в 10 раз исследуемой плазме добавляют раствор тромбина и определяют время до образования сгустка. Концентрацию фибриногена в исследуемой плазме находят по калибровочному графику. Если она превышает 5-6 г/л, для получения корректных данных рекомендуют повторить определение, разведя плазму буферным раствором не в 10, а в 20 раз, полученный результат умножить на 2.
Турбидиметрический метод схож с тестом рептилазного времени, но исследование проводят не на коагулометре, а на фотометрическом анализаторе, позволяющем определить кинетику нарастания мутности среды. Скорость помутнения при образовании фибрина зависит от исходной концентрации фибриногена в плазме, которая определяется по результатам исследования калибровочных проб (требуется многоточечная калибровка). Турбидиметрический метод используют в некоторых автоматических анализаторах гемостаза, в этом же тесте можно одновременно определить протромбиновое время.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
У взрослых - 1,8-4,0 г/л, у новорожденных - 1,2-3,0 г/л.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Хронометрический метод может давать некорректные результаты при дисфибриногенемии, а также при попадании в кровь большого количества гепарина (например, из венозного катетера). При исследовании капиллярной крови результат зависит от действия множества дополнительных интерферирующих факторов (форменных элементов крови, разного гематокрита), что снижает точность метода.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества определения фибриногена используют контрольную РНП-плазму, для калибровки - разведения стандартной плазмы либо стандартные растворы фибриногена. Разброс результатов при работе с одной и той же пробой плазмы не должен превышать 5%. Показания разных методов на одной и той же пробе плазмы могут существенно отличаться друг от друга, особенно при гипо- или гиперфибриногенемии. Именно поэтому в лаборатории рекомендуют придерживаться какого-либо одного метода, тщательно отладив его и регулярно проводя калибровку и контроль качества.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Фибриноген синтезируется в печени и относится к группе белков острой фазы. Повышение его концентрации в плазме возможно при любой острофазовой реакции (воспалении, инфекциях, ожогах, травмах, в послеоперационном периоде, остром инфаркте миокарда), а также при болезнях почек, системных заболеваниях соединительной ткани, злокачественных новообразованиях и др. У здоровых женщин уровень фибриногена возрастает при беременности, введении эстрогенных препаратов и во время менструации.
Основные причины снижения содержания фибриногена - гиперпотребление при образовании большого количества микросгустков, распад в результате действия фибринолитических препаратов (стрептокиназы и т. п.) или нарушение синтеза при тяжелой патологии печени (циррозе, острой дистрофии), а также значительная гемодилюция. Необходимо учитывать, что тяжелые гнойно-воспалительные процессы, приводящие к развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, могут способствовать повышению уровня фибриногена как острофазного белка и тем самым маскировать его усиленное потребление.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение концентрации фибриногена - базовый метод исследования коагуляционных свойств плазмы, входящий во все скрининговые схемы. Исследование проводят для выявления причины и оценки степени риска кровотечений и тромбозов. При увеличении концентрации фибриногена резко повышается вязкость крови, но ее свертывание in vitro не ускоряется. Длительно повышенная концентрация фибриногена опасна, поскольку возрастает риск тромбозов и ишемии органов и тканей. При уменьшении количества фибриногена ниже 1 г/л возможны кровотечения.
Фактор VIII (активность)
Плазменный фактор VIII (антигемофильный глобулин) синтезируется в печени, селезенке, клетках эндотелия, лейкоцитах, почках. В крови фактор VIII находится в комплексе с фактором фон Виллебранда, который стабилизирует фактор VIII и существенно увеличивает период его циркуляции (до 12-24 ч). При воздействии минимального количества тромбина фактор VIII высвобождается из комплекса и проявляет свой прокоагулянтный эффект.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. В связи с малой стабильностью фактора VIII плазма должна быть получена в кратчайшие сроки. В свежезамороженной плазме при быстром и правильном оттаивании активность фактора VIII мало отличается от свежей плазмы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В клоттинговом тесте определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси субстратной плазмы, дефицитной по фактору VIII (
В хромогенном методе инкубация разведенной исследуемой плазмы с добавлением фактора Ха, фосфолипидов, Са2+ и избытка фактора X приводит к активации последнего, чему способствует фактор VIII. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с освобождением окрашенного я-нитроанилина. Образующийся в смеси тромбин, также способный гидролизовать хромогенный субстрат, блокируется добавляемым синтетическим ингибитором. Скорость нарастания оптической плотности при А=405 нм пропорциональна активности фактора VIII в исследуемой плазме. Смешивают препараты факторов Ха и X, фосфолипидов, добавляют разведенную буферным раствором исследуемую плазму, хромогенный пептидный субстрат и при 37 °С определяют скорость нарастания оптической плотности при V=405 нм кинетическим методом. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом, результат выражают в процентах стандартной нормальной плазмы. Каждый образец исследуют дважды, вычисляют среднеарифметическое значение. Диапазон линейности метода - от 0 до 130%.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Те же, что в тесте активированного частичного тромбопластинового времени. Активность фактора VIII нельзя определять при наличии в пробе гепарина или на фоне его действия.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют контрольную плазму, активность фактора VIII в которой указывается в аттестате и соответствует нормальному (80-120%; 0,8-1,2 МЕ/мл) и патологическому уровню.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VIII наиболее часто связано с нарушением его синтеза (при гемофилии А) или появлением ингибиторных антител, а также с ускоренным распадом («незащищенностью» фактора VIII при болезни фон Виллебранда); реже - с гиперпотреблением. При уровне фактора VIII от 6 до 25% констатируют недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней, менее 1% - тяжелой степени. Существенное снижение уровня фактора VIII сопровождается кровотечением после травм и кровоизлияниями в суставы, мышцы и другие органы и ткани. При снижении активности фактора VIII в плазме менее 25% увеличивается риск развития послеоперационных кровотечений. Активность фактора VIII возрастает при острофазовых реакциях (воспалении, травмах и т. д.), беременности и лечении эстрогенными препаратами, после спленэктомии, а также может увеличиваться при сахарном диабете и опухолевом процессе. Активность фактора VIII, превышающую 175%, расценивают как тромбофилическое состояние.
Фактор IX (активность/количество)
Плазменный фактор IX, или фактор Кристмаса, синтезируется в печени (синтез зависит от витамина К). При каскадной активации внутреннего пути гемостаза активированный фактор IX в составе теназного ферментного комплекса (на фосфолипидной матрице) способствует переходу фактора X в активную форму, образованию протромбиназы, тромбина и фибринового сгустка. В процессе свертывания крови фактор IX не потребляется и остается в сыворотке.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Принцип определения клоттинговым методом такой же, как при исследовании активности фактора VIII, но в качестве субстрата используют плазму, дефицитную по фактору IX. Иммуноферментное определение основано на связывании определяемого фактора IX с фиксированными на поверхности лунки планшета моноклональными антителами к данному фактору и их конъюгатом с пероксидазой; калибровку осуществляют по разведениям стандартной калибровочной плазмы, входящей в набор.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% (0,5-1,5 МЕ/мл).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора IX может быть связано с нарушением его синтеза (гемофилией В, тяжелыми гепатитами и циррозами печени, лечением непрямыми антикоагулянтами), а также с появлением ингибиторных антител. При уровне фактора от 25 до 50% констатируют скрытую недостаточность, от 6 до 24% - недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней степени, менее 1% - тяжелую форму недостаточности. Выраженная недостаточность фактора IX сопровождается геморрагическими проявлениями, минимальный уровень активности в крови для предупреждения послеоперационных кровотечений составляет 20-25% нормы. Количество/активность фактора IX могут возрастать при лечении эстрогенными препаратами и при почечной недостаточности. Если активность фактора IX превышает 200%, развивается тромбофилическое состояние.
Фактор X(активность/количество)
Витамин К-зависимый фактор X (фактор Стюарта-Прауэра) синтезируется в печени и занимает одно из центральных мест в системе плазменного гемостаза. При каскадной активации как внутреннего, так и внешнего пути гемостаза фактор X превращается в активную протеазу - фактор Ха, который в присутствии других компонентов протромбиназного комплекса (фактора Va, фосфолипидов и Са2+) превращает протромбин в тромбин и способствует образованию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Изолированная недостаточность фактора X в исследуемой плазме может быть обнаружена по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени и особенно протромбиновое время, которые приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются удлиненными при добавке дефицитной по ф. X плазмы.
Количественное определение фактора X в клоттинговом тесте проводят аналогично исследованию активности фактора VIII, но вместо активированного частичного тромбопластинового времени применяют тест протромбиновое время и используют плазму, дефицитную по данному фактору. Антиген к фактору X может быть определен иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител. Методом определяют количество, но он не дает представления об активности анализа. При применении хромогенного метода фактор X в разведенной исследуемой плазме переводится в активное состояние специфическими протеазами из яда гадюки Рассела (Russel Viper Venom - RVV) в присутствии Са2+. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с высвобождением окрашенного нитроанилина; скорость нарастания оптической плотности при > или =405 нм пропорциональна концентрации фактора X. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализа¬торе гемостаза с фотометрическим каналом; результаты выражаются в процентах активности фактора в стандартной плазме (линейность метода - от 10 до 130%).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150%.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Исследование необходимо провести не позднее 2 ч после взятия крови. Липемичные, иктеричные и гемолизированные образцы исследовать не рекомендуют; в противном случае необходим бланк-контроль с плазмой пациента. Для контроля качества используют нормальную и патологическую плазмы с аттестованным уровнем фактора X. Оценку метода можно проводить с использованием РНП-плазмы или свежей (свежеразмороженной) пулированной плазмы от нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора X чаще бывает связано с нарушением его синтеза в печени (дефицитом витамина К, действием непрямых антикоагулянтов, тяжелой патологией печени) или исчезновением из кровеносного русла при амилоидозе (изолированной недостаточностью фактора X). Концентрация фактора X может также снижаться при гепаринотерапии из-за связывания и инактивации комплексом «АТ-гепарин». Врожденный дефицит фактора наблюдается редко.
Исследование проводят при сочетанном удлинении активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени для выявления причины гипокоагуляции. Минимальный гемостатический уровень активности фактора X в крови - 5-10%, для послеоперационной остановки кровотечения - 10-20% нормы. Более выраженное уменьшение сопровождается кровоточивостью.
Поскольку активность синтезируемого в печени фактора X снижается под влиянием антикоагулянтов непрямого действия, наряду с активностью протромбина ее можно применять при мониторинге терапии варфарином.
Фактор VII (активность/количество)
Плазменный витамин К-зависимый фактор VII (проконвертин) синтезируется в печени и циркулирует в крови. При повреждении тканей и попадании в кровоток тканевого фактора образуется активная форма фактора Vila, которая в виде комплекса «ТФ-фактор Vila» активирует факторы IX и X, что, в свою очередь, приводит к образованию тромбина и формированию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Клоттинговый метод основан на коррекции удлиненного протромбинового времени исследуемой плазмы добавкой нормальной пулированной плазмы, но отсутствии коррекции в микс-тесте плазмы больного и субстратной плазмы, дефицитной по фактору VII. Имеется информация о хромогенном методе определения фактора VII, основанном на образовании комплекса «ТФ-VIIa», активирующего добавляемый фактор X, который впоследствии гидролизует хромогенный субстрат с образованием окрашенного я-нитроанилина. Иммуноферментный анализ (ELISA) позволяет определять как общее количество проконвертина и его комплекса с тканевым фактором (VII+VIIa+ТФ/ VII+TФ/VIIa), так и активную форму (VIIa+T/VIIa), которая в норме составляет около 1% (~5 нг/мл).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-200%; при определении методом ELISA - 300-800 нг/мл.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Дополнительная нестабильность результатов в клоттинговом и хромогенном тестах связана с возможностью самопроизвольной и Холодовой активации фактора VII (плазму крови нежелательно долго выдерживать при низкой температуре). Вместе с тем быстрое замораживание плазмы мало изменяет активность данного фактора. Гепарин* в концентрации до 0,5 ЕД/мл не влияет на результаты хромогенного исследования.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют аттестованную по фактору VII контрольную плазму, РНП-плазму или свежую (свежеразмороженную) пулированную плазму от нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VII возможно при нарушении его синтеза в печени (в периоде новорожденности, при тяжелой патологии органа - гепатите, циррозе, дефиците витамина К и лечении непрямыми антикоагулянтами) и при коагулопатии потребления. Врожденная недостаточность проконвертина встречается очень редко. Повышение активности фактора VII возможно при активации его синтеза в печени (действии эстрогенных препаратов, в III триместре беременности и т. д.).
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фактор VII отличается наиболее коротким периодом циркуляции в кровеносном русле (Т 1/2=4-7 ч); прогрессирующее снижение его активности может рассматриваться как один из маркеров острой печеночной недостаточности. Повышение количества/активности фактора VII расценивается как тромбофилическое состояние, может сопровождаться возрастанием риска сердечно-сосудистых заболеваний.
Фактор V(активность/количество)
Плазменный фактор V (проакцелерин) синтезируется в печени, в крови циркулирует в неактивном виде, содержится в тромбоцитах. После протеолитической активации фактор Va выступает в качестве основного кофактора фактора Ха, повышая его активность на несколько порядков. В свою очередь, фактор Ха в составе протромбиназного ферментного комплекса (факторов Ха, Va, фосфолипидов и Са2+) вызывает образование тромбина и способствует формированию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Недостаточность фактора V может быть заподозрена в клоттинговом тесте при удлинении ПВ. Показатели приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются патологическими при добавке дефицитной по фактору V плазмы. Клоттинговое определение фактора V аналогично исследованию активности фактора VIII, но проводят по тесту протромбинового времени с использованием субстратной плазмы, дефицитной по фактору V.
Количественное определение проводят ИФА-методом с использованием моноклональных антител к тяжелой цепи фактора V и конъюгата пероксидазы с поликлональными антителами к данному белку. Метод дает представление о количестве, но не о реактивности фактора.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% уровня нормальной пулированной плазмы.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора V может быть связано с нарушением синтеза в печени (тяжелой патологией печени) или чрезмерным потреблением; врожденный дефицит наблюдается очень редко. Повышение активности фактора V возможно при ускорении его синтеза в печени (острой фазе заболеваний, беременности и т. д.). Исследование проводят для дифференциации причин удлинения протромбинового времени на фоне нормального активированного частичного тромбопластинового времени. Минимальный гемостатический уровень активности фактора V в крови составляет 5-15%, для выполнения операций - 25%.
Фактор XIII (фибриназа, фибринстабилизирующий фактор)
Фибриназа (фактор XIII, трансглутаминаза) путем образования перекрестных ковалентных связей стабилизирует растворимый фибрин-полимерный сгусток и превращает его в плотный тромб. Сгустки, образовавшиеся с участием фибриназы, лизируются медленно. Если же активность фактора XIII снижена, сгустки распадаются быстро, даже когда фибринолитическая активность крови нормальная.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Функциональное определение основано на оценке лизиса фибринового сгустка, образуемого из стандартного раствора фибриногена с добавкой различных разведений исследуемой плазмы, содержащей фактор XIII, в растворе монохлоруксус- ной кислоты (или оксалата мочевины). Метод достаточно субъективен на стадии оценки результатов. Фотометрический энзиматигеский метод основан на действии фактора XIHa, на синтетическом субстрате и определении количества отщепляющихся ионов аммония в глутаматдегидрогеназной реакции на фотометре или биохимическом анализаторе. Иммуноферментный метод (ELISA) на основе поликлональных антител к эпи-топам молекулы фактора XIII высокочувствителен и обладает хорошей воспро-изводимостью. Метод позволяет определять количество фибриназы, но не дает информации об ее активности.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. Плазма должна быть исследована не более чем через 4 ч после взятия крови. Нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки и следы гемолиза. Допустимо однократное замораживание плазмы с последующим оттаиванием в теплой воде.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К последовательным разведениям исследуемой плазмы буферным раствором (от 1:2 до 1:512) добавляют стандартный раствор фибриногена, суспензию каолина и тромбин-кальциевую смесь. В ходе 30-минутной инкубации при 37 °С образуется сгусток фибрина, в разной степени упрочненный действием фактора XIII. После добавления монохлоруксусной кислоты и 5-минутной инкубации встряхивают пробирки и отмечают наименьшее разведение плазмы, при котором сгусток разрушается на мелкие фибриновые нити. Параллельно тестируют аналогичные разведения входящей в набор плазмы-калибратора с известной активностью фибриназы (в процентах нормальной плазмы). Уровень фактора XIII рассчитывают по наименьшим титрам плазмы, в которых произошел распад сгустка, с учетом известной активности фактора XIII в плазме-калибраторе.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 60-150% уровня нормальной плазмы.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества анализа используют контрольные плазмы с нормальными и патологическими уровнями фактора XIII. Функциональный метод не может быть стандартизирован, поскольку оценка распада сгустка в значительной степени субъективна.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение фактора XIII в крови может быть связано с нарушением его синтеза либо с гиперпотреблением. Активность фибриназы бывает сниженной у новорожденных и детей первого месяца жизни. Приобретенный дефицит фактора XIII может развиваться у больных с лучевой болезнью, лейкозами, гепатитами и циррозами, метастазами опухолей в печень, лимфомой. Описано существенное снижение активности фактора XIII (
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клиническая значимость теста в целом невелика. Снижение или повышение активности фибриназы рассматривают как фактор геморрагического или тромботического риска. Вместе с тем считается, что 10% фибриназы обеспечивают полноценный гемостаз, а 2% этого фактора достаточны для остановки кровотечения.
Время свертывания - это время, которое проходит от момента взятия образца крови из вены до её полного сгущения в пробирке. Процесс свертывания крови может быть осуществлен путем примесной активации (на основе тканевого тромбопластина) или путем эндогенной активации (при контакте с отрицательно заряженной поверхностью, например, коллаген в поврежденной стенке сосуда).
Активация этих систем запускает каскад реакций, в которых основную роль играют факторы свертывания плазмы. Именно они приводят, в конечном итоге, к трансформации фибриногена в фибрин, который образует сгусток крови и останавливает кровотечение.
Время свертывания крови используется для оценки правильного протекания всех этих процессов. Причиной его продления может быть, например, дефицит какого-либо из факторов плазмы, участвующих в процессе свертывания крови .
Следует, однако, помнить, что из-за отсутствия стандартизации метода и низкой воспроизводимости метода определения результатов, а также из-за наличия более совершенных методов, время свертывания теперь используется редко.
Определение и допустимое время свертывания крови
Время свертывания исследуют на пробе венозной крови, взятой из локтевой вены. На забор крови для исследования необходимо приходить натощак, последний прием пищи следует проводить не позже, чем за 8 часов перед исследованием.
Время свертывания крови оценивается, чаще всего, методом Ли-Уайта . Этот метод позволяет оценить эффективность всей системы коагуляции , с акцентом на активность фактора Хагемана (это двенадцатый фактор свертывания крови).
Если измерение проводится в стеклянных пробирках, в зависимости от температуры, правильные значения составляют 4-10 минут (при температуре 37 градусов), а 6-12 минут (при температуре 20 градусов).
Следует, однако, помнить, что из-за трудностей в стандартизировании метода, трудно однозначно определить правильное значение времени свертывания крови и, следовательно, результаты могут отличаться в различных лабораториях.
Кроме того, необходимо учитывать, что на время свертывания крови влияют такие факторы, как:
- размер пробирок;
- тип материала, из которого была сделана пробирка (стекло, силикон);
- тип стекла, из которого выполнена пробирка.
Учитывая все эти зависимости и большое расхождение результатов измерения времени свертывания крови, он был заменен тестом на протромбиновое время и активированное частичное тромбопластиновое время.
Интерпретация результатов времени свертывания крови
Удлинение времени свертывания крови происходит в случаях:
- лечение гепарином - это вещество, которое тормозит процесс свертывания, а его применение требует мониторинга системы гемостаза; однако, из-за вышеупомянутой трудности в определении времени свертывания, как правило, используется для контроля лечения нефракционированным гепарином; для этого используется тест АЧТВ. Если, однако, даже если мы используем определение времени свертывания в случае использованиягепарина должна быть расширена с 1,5 до 3 раз нормальные значения;; если, однако, несмотря на это, мы используем определение времени свертывания, в случае применения нефракционированного гепарина допустимые значения должны быть увеличены в 1,5 - 3 раза;
- дефицит факторов свертывания - II, V, VIII, IX, X, XI, XII - дефицит этих факторов приводит к возникновению плазменного диатеза - причиной его возникновения может быть нарушение синтеза этих факторов в ходе различных заболеваний печени;
- гемофилия - врожденный изъян системы свертывания крови, вызванный дефицитом факторов VIII, IX или XI; болезнь требует постоянного пополнения недостающего фактора, особенно перед планируемыми процедурами или хирургическими операциями, в противном случае доходит до угрожающих жизни кровотечений;
- циркулирующие антикоагулянты - антифосфолипидные антитела, появляющиеся при антифосфолипидном синдроме и системной красной волчанке .
Помните, что правильное время свертывания крови не указывает на отсутствие нарушений гомеостаза. Результат исследования на свертываемость крови может быть фальсифицирован, если проводить его во время менструации и в период беременности.
Плазменные факторы свертывания крови.Фактор I - фибриноген - белок, находящийся в плазме в растворенном состоянии. В процессе свертывания крови он становится нерастворимым, образуя фибрин.
Фактор II - протромбин - белок плазмы - неактивный предшественник тромбина. Тромбин (IIа) способствует превращению фибриногена в фибрин, активирует тромбоциты, из которых под его влиянием освобождаются клеточные факторы свертывания.
Фактор III - тканевой тромбопластин (тканевой фактор) - липопротеид, который освобождается при повреждении тканей, поступая в плазму крови, он воздействует на протромбин, превращая его в тромбин. Аналогичным действием обладает тромбокиназа плазмы.
Фактор IV - ионизированный кальций.
Фактор V - проакцелерин, Ас-глобулин, лабильный фактор, акцелератор превращения протромбина.
Фактор VI - акцелерин - белок глобулиновой природы, ускоряющий превращение протромбина в тромбин.
Фактор VII - проконвертин, стабильный фактор, неактивная форма фермента конвертина.
Фактор VIII - антигемофильный глобулин, принимает участие в образовании тромбокиназы.
Фактор IX - фактор Кристмаса, антигемофильный глобулин-В - катализирует образование тромбокиназы.
Фактор Х - фактор Стюарта-Прауэра, участвует в образовании тромбокиназы и непосредственно в превращении протромбина в тромбин.
Фактор ХI - фактор Розенталя - ускоряет образование тромбокиназы.
Фактор XII - фактор Хагемана, контактный фактор.
Фактор ХIII - фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, участвует в переходе растворимого фибрина в нерастворимую форму.
Кроме плазменных, в свертывании участвует ряд клеточных факторов, выделяемых форменными элементами крови.
Первостепенную роль играют тромбоцитарные факторы. Обозначаются они как Р1, 2, 3, 4, РII. При агрегации тромбоцитов из них выделяются вещества, которые ускоряют процесс свертывания крови. Наибольшее значение для свертывания имеет тромбоцитарный фактор 3 (фосфолипид).
Большинство из вышеперечисленных ферментов синтезируется в печени. Для синтеза факторов II, VII, IX и Х необходим витамин К.
Свертывание крови условно протекает в 3 фазы.
Фаза 1 - формирование активной протромбокиназы.
Имеются 2 механизма активации свертывания крови - “внешний” (при поступлении в кровь тканевого тромбопластина) и “внутренний” (без тканевого тромбопластина).
При внешнем механизме активации фактор III (из поврежденных тканей или разрушенных форменных элементов) вступает во взаимодействие с фактором VII и в присутствии ионов кальция быстро образует активатор фактора Х. Активированный фактор Х (Ха) в комплексе с фактором V, фактором 3 тромбоцитов и ионами кальция трансформируют протромбин.
Во внутреннем механизме участвуют факторы ХII, ХI, IХ, VIII наряду с факторами Х, V, тромбоцитарным фосфолипидом и ионами кальция, которые являются общими для обоих механизмов.
Каскад свертывания состоит в следующем: контакт крови с чужеродной поверхностью (например, стекло пробирки при запуске механизма in vitro) активирует фактор XII, который активирует фактор ХI, тот в свою очередь фактор IХ. Активированный фактор IХ (IХа) в присутствии фосфолипида, ионов кальция и фактора VIII активирует фактор Х. Активированный фактор Х (Ха) в сочетании с фосфолипидом, фактором V и кальцием (протромбокиназа) участвует в превращении протромбина.
Фаза 2 - тромбинообразование - состоит в превращении протромбина в тромбин под влиянием активного комплекса протромбокиназы. В основе превращения протромбина лежит расщепление его молекулы на фракции, одна из которых с молекулярной массой 37 тыс. переводится фактором Ха в тромбин. Реакция требует наличия ионов кальция и ускоряется в присутствии фактора V и фосфолипида.
Фаза 3 - фибринообразование - состоит в превращении фибриногена в фибрин при участии тромбина. Тромбин отщепляет от фибриногена по два пептида А и В, что ведет к полимеризации оставшихся фибрин-мономеров с образованием фибрин-полимера, растворимого в мочевине.
Стабилизация молекулы фибрина происходит под влиянием активированного тромбином фактора ХIIIа и состоит в формировании поперечных глютамин-лизиновых связей между единицами фибрина, в результате чего образуется прочная (не растворимая в мочевине, монохлоруксусной кислоте и других растворителях) фибриновая сетка.
Наиболее общее представление о коагуляции дает время свертывания цельной крови. Простым и удобным является метод Моравица: на часовое стекло наносят каплю крови, взятой из пальца или мочки уха, диаметром 4-6 мм. Тонким запаянным стеклянным капилляром проводят каждые 30 сек. по поверхности капли. Время свертывания определяют в момент появления первых фибриновых нитей, тянущихся за капилляром.
В методе Ли-Уайта используют венозную кровь. Пробирку с 1 мл венозной крови устанавливают на водяной бане при 37 °С и включают секундомер. Через каждые 30 сек. пробирку наклоняют под углом 45°. Время от момента взятия крови до появления сгустка является временем свертывания крови.
У здоровых людей время свертывания цельной крови составляет 5-8 мин.
Общую оценку конечного этапа свертывания крови дает тромбиновое время, т.е.
время свертывания цитратной плазмы крови под влиянием стандартной дозы тромбина.
Метод Сирман в модификации Рутберга: в пластиковую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой крови, добавляют 0,1 мл подогретого до 37 °С изотонического раствора хлорида натрия и инкубируют смесь в течение 60 сек. при 37 °С. Затем вносят 0,1 мл стандартизированного раствора тромбина (раствор тромбина такой активности, который в смеси с равным объемом донорской плазмы вызывает свертывание последней за 15 с), включают секундомер и отмечают время свертывания плазмы крови. В норме тромбиновое время равно 14-16 сек.
Метод определения фибриногена по Рутбергу. К 1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл 5%-ного раствора хлорида кальция и 0,1 мл раствора тромбина (активность - 15 сек.). Образовавшийся сгусток переносят на обеззоленный бумажный фильтр и просушивают другим фильтром до сухого состояния. Взвешивают сухой фибрин на торсионных весах. В норме масса сухого фибрина - 9-12 мг. Для расчета концентрации фибриногена в плазме крови массу сгустка умножают на экспериментально установленный коэффициент 22,2. В норме концентрация фибриногена в крови равна 0,2-0,4 г в 100 мл.
Для выявления заблокированных продуктов деградации фибриногена (ПДФ) и фибрин-мономеров, что характерно для диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), применяют так называемые паракоагуляционные пробы (этаноловую, протамин-сульфатную, b -нафтоловую) и тесты с протеазами из некоторых змеиных ядов.
Тест на толерантность плазмы к протамин-сульфату. В 1-й пробирке проводят определение времени свертывания цитратной плазмы крови под влиянием тромбина (тромбиновое время), во 2-й - то же определение, но после добавления равного объема (0,1 мл) 0,01%-ного раствора протамин-сульфата. Разница во времени свертывания плазмы крови в 1-й и 2-й пробирках в норме составляет 7-10 сек. Увеличение этой разницы (более 7-10 сек) свидетельствует об увеличении в крови гепарина (протамин-сульфат обладает способностью связывать свободный гепарин) и других антитромбинов.
Если конечный этап свертывания не нарушен (тромбиновое время нормально), то раздельно оценивают внешний и внутренний механизмы активации свертывания (формирование протромбиназы, трансформирующей протромбин в тромбин). Внешний механизм суммарно оценивают с помощью теста протромбинового времени по Квику (времени свертывания рекальцинированной цитратной плазмы при добавлении к ней тканевого тромбопластина стандартизированной активности).
Метод Квика В пробирку вносят 0,1 мл испытуемой плазмы крови, 0,1 мл суспензии тромбопластина (активность тромбопластина тестируется на нормальной донорской плазме), ставят в водяную баню при 37 °С на 60 сек. Затем приливают 0,1 мл 0,025 М хлорида кальция и включают секундомер. Отмечают время свертывания крови. Опыт повторяют 2-3 раза и определяют средний показатель.
Протромбиновое время при стандартизированном тромбопластине в норме составляет 12-15 сек. Поскольку могут быть отклонения в активности отдельных серий тромбопластина, то прибегают к вычислению протромбинового индекса по формуле:
Где А - протромбиновое время плазмы крови донора;В - протромбиновое время исследуемого лица.
В норме этот показатель равен 80-100%.
При нормальном тромбиновом времени нарушения внешнего механизма могут быть обусловлены дефицитом факторов VII, Х, V или II, поскольку все они определяются протромбиновым временем. При нормальном тромбиновом и протромбиновом времени нарушения внутреннего механизма свертывания зависят только от факторов ХII, ХI, IХ и VII. Для оценки внутреннего пути активации свертывания крови используют общие коагуляционные тесты: время свертывания цельной крови, парциальное (частичное) тромбопластическое время (или каолин-кефалиновое время), аутокоагуляционный тест.
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы крови в стандартных условиях, создаваемых внесением каолина - активатора ХII фактора и кефалина - аналога 3-тромбоцитарного фактора, для исключения влияния тромбоцитов на результат исследования (метод Proctor с соавт.). В пластиковую пробирку вносят 0,1 мл бедной тромбоцитами цитратной плазмы, 0,1 мл каолин-кефалиновой суспензии, смешивают и инкубируют при 37 °С в течение 3 мин. Добавляют 0,025 М хлорида кальция равного объема (0,1 мл), подогретого до 37 °С, и включают секундомер. Отмечают время образования сгустка. В норме активированное частичное тромбопластиновое время составляет 30-40 сек.
Аутокоагуляционный тест (АКТ) (по Беркарда с соавт.). Стандартизация фосфолипидной и контактной активации начальной фазы процесса свертывания осуществляется добавлением к рекальцинированной плазме крови гемолизата эритроцитов исследуемого больного (аутотест).
По данным, полученным через 2-6-8-10-20-30-40-50-60 мин после добавления гемолизат-кальциевой смеси, строят график, восходящая часть которого отражает динамику нарастания активности тромбопластина и тромбина, нисходящая часть - скорость инактивации тромбина за счет антитромбинов и продуктов фибринолиза.
Глава 3. Клинико-лабораторные алгоритмы оценки системы гемостаза в организме
Последняя, четвертая, фаза состоит из спонтанного фибринолиза.
Фибринолиз процесс, приводящий к растворению тромба. Длительность его 48-72 ч. Система фибринолиза представлена белком крови плазминогеном, который после активации превращается в активный плазмин, обладающий ферментными свойствами, характерными для протеиназ. Сюда же входят активаторы и ингибиторы фибринолиза.
В результате фибринолиза в плазме появляются и нарастают продукты деградации фибрина (ПДФ), к числу которых относитсятся и Д-димеры. Причем
их нарастание при проведении тромболизистной терапии часто свидетельствует об эффективности лечения.
Антикоагулянтная система
В формировании антикоагулянтной системы так же как и в прокоагулянтном звене, участвуют белковые факторы плазмы, тромбоцитов и тканей. Суммарная активность противосвертывающей системы крови складывается из активности собственно антикоагулянтов и активности системы фибринолиза . Функция фибринолитической системы сводится к растворению уже сформировавшихся в кровяном русле сгустков фибрина, то есть эти два звена противосвертывающей системы крови взаимно дополняют друг друга.
Антитромбин III (АТ III) - универсальный ингибитор почти всех ферментных факторов свертывания.На его долю приходится более 75% всей антикоагулянтной активности плазмы, причем он является основным кофактором гепарина.
Гепарин в малых дозах ингибирует факторы Xa, IXa, VIII. Высокие дозы гепарина ингибируют все фазы свертывания крови.
A 2 -макроглобулин ингибирует тромбин, калликреин, плазмин, трипсин. A 2- антитрипсин ингибирует факторы XIa, IIa и плазмин
Роль витамина К
Характеризуя функциональные компоненты прокоагулянтного звена гемостаза, следует остановиться на участии витамина К в активации отдельных плазменных факторов свертывания крови.
Витамин К (хинон) относится к жирорастворимым витаминам, поступает в организм с пищей, а так же синтезируется микрофлорой кишечника. Поэтому авитаминозы К встречаются редко, обычно в случаях нарушения процессов всасывания жиров в кишечнике.
Факторы системы гемостаза, для полноценного функционирования которых необходим витамин К, называются витамин К-зависимыми факторами. К ним относятся: фактор II (протромбин), факторы VII, IX, Х и два антикоагулянта - протеин С и протеин S. После синтеза в гепатоцитах они требуют определенной модификации. При отсутствии витамина К этот процесс блокируется, что приводит к синтезу функционально неполноценных факторов свертывания, которые не могут взаимодействовать с ионами Са2+ , фосфолипидными поверхностями и формировать активные комплексы необходимые для свертывания крови.
Такие факторы называются «белками, появляющимися при отсутствии витамина К» и обозначаются в виде аббревиатуры от английского эквивалента данного названия «РIVКА» (Рroblеminduced by vitamin K absence).
Несмотря на то, что собственно авитаминозы К встречаются редко, в клинической практике приходится сталкиваться с явлением функциональной внутриклеточной недостаточности витамина К .
Оно возникает на фоне приема пероральных антикоагулянтов группы кумаринов (дикумарол, кумадин, синтром, маркумар, варфарин ), как результат ингибирования ферментов которые участвуют, как было отмечено, в депонировании и освобождении витамина К в тканях.
В крови пациентов, получающих данные антикоагулянты, образуются много РIVКА, которые выключаются из процесса свертывания крови и, как следствие этого, развивается состояние гипокоагуляции.
Особенности исследования состояния системы гемостаза
Для оценки функций системы свертывания крови используются различные тесты время свертывания крови, длительность кровотечения, а также ряд показателей, характеризующих различные фазы свертывания.
Однако в связи с тем, что в суспензии каолина отсутствуют фосфолипиды, его воспроизводимость существенно ниже АПТВ-теста. Каолиновый тест нецелесообразно применять для обнаружения каких-либо коагулопатий, однако тест пригоден для выявления ВА.
Принцип метода
Определяют скорость образования сгустка фибрина после рекальцификации смеси, содержащей цитратную БТП и каолин. Последний активирует коагуляционный фактор XII, поэтому его результаты отклоняются от нормы при недостаточности многих коагуляционных факторов (I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII), наличии ингибиторов свертывания, а также у пациентов, применяющих антикоагулянты.
Реактивы и оборудование
- Суспензия каолина в буфере (рН 7,4).
- Раствор кальция хлорида (0,025 М).
- Коагулометр (при отсутствии коагулометра - водяная баня и секундомер).
Образцы крови для исследования Для выполнения теста используют БТП. Поскольку тест фосфолипид-зависимый, весьма важны правильные режим и время проведения центрифугирования. Для эффективного удаления тромбоцитов целесообразно использовать двойное центрифугирование образцов (подробнее см. приложение 3).
Техника выполнения
В кювете коагулометра (или пробирке при мануальной технике выполнения) смешивают 0,1 мл исследуемой БТП и 0,1 мл взвеси каолина. Затем инкубируют эту смесь при температуре +37 °С в течение 3 мин. После инкубации в кювету (или пробирку при мануальной технике выполнения) добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида, имеющего температуру +37 °С, в тот же момент включают таймер коагулометра (или секундомер при мануальной технике выполнения) и регистрируют время коагуляции.
Оценка результатов исследования
Каолиновое время свертывания оценивают в секундах. Необходимо определить время свертывания не только исследуемой БТП, но и контрольной нормальной плазмы. Нормативы существенно зависят от техники определения и варианта коагулометра, поэтому каждой лаборатории следует уточнить локальный диапазон нормальных значений.
Сравнивают результаты каолинового теста в исследуемой плазме с аналогичным показателем у здорового донора. Отклонением от нормы следует считать удлинение времени свертывания на 25 % от значения, полученного при исследовании контрольной БТП.
Интерпретация результатов исследования Пролонгированные показания в каолиновом тесте наблюдаются при снижении любого коагуляционного фактора, кроме факторов VII и XIII. Кроме того, этот тест отклоняется от нормы при наличии в крови различных ингибиторов коагуляции, в т. ч. ВА. Значительное удлинение в каолиновом тесте, а зачастую и несвертываемость обуславливает гепарин.
Укорочение времени коагуляции в каолиновом тесте часто обусловлено дефектами преаналитического этапа исследования.
Причины ошибок
- Ошибки преаналитического этапа исследования, в т. ч. неправильная дозировка цитрата при заборе венозной крови.
- Дефекты центрифугирования при получении образцов БТП.
- Попадание в исследуемую кровь гепарина из венозного катетера.
- Гемолиз.
Другие аналитические технологии Существует вариант метода, оценивающий время коагуляции в богатой тромбоцитами плазме. Однако целесообразность его применения в повседневной диагностической практике вызывает сомнения.
