Основными элементами иммунной системы организма являются белые клетки крови – лимфоциты, существующие в двух формах. Обе формы происходят из клеток-предшественников в костном мозге, т.н. стволовых клеток. Незрелые лимфоциты покидают костный мозг и попадают в кровяное русло. Некоторые из них направляются к тимусу (вилочковой железе), расположенному у основания шеи, где происходит их созревание. Прошедшие через тимус лимфоциты известны как Т-лимфоциты, или Т-клетки (Т от «тимус»). В экспериментах на цыплятах было показано, что другая часть незрелых лимфоцитов закрепляется и созревает в сумке Фабрициуса – лимфоидном органе около клоаки. Такие лимфоциты известны как В-лимфоциты, или В-клетки (B от bursa – сумка). У человека и других млекопитающих В-клетки созревают в лимфатических узлах и лимфоидной ткани всего организма, эквивалентных сумке Фабрициуса у птиц.
Оба типа зрелых лимфоцитов имеют на своей поверхности рецепторы, которые могут «узнавать» специфический антиген и связываться с ним. Контакт В-клеточных рецепторов со специфическим антигеном и связывание определенного его количества стимулируют рост этих клеток и последующее многократное деление; в результате образуются многочисленные клетки двух разновидностей: плазматические и «клетки памяти». Плазматические клетки синтезируют антитела, выделяющиеся в кровоток. Клетки памяти являются копиями исходных В-клеток; они отличаются большой продолжительностью жизни, и их накопление обеспечивает возможность быстрого иммунного ответа в случае повторного попадания в организм данного антигена.
Что касается Т-клеток, то при связывании их рецепторами значительного количества определенного антигена они начинают секретировать группу веществ, называемых лимфокинами. Некоторые лимфокины вызывают обычные признаки воспаления: покраснение участков кожи, местное повышение температуры и отек за счет увеличения кровотока и просачивания плазмы крови в ткани. Другие лимфокины привлекают фагоцитирующие макрофаги – клетки, которые могут захватывать и поглощать антиген (вместе со структурой, например бактериальной клеткой, на поверхности которой он находится). В отличие от Т- и В-клеток эти макрофаги не обладают специфичностью и атакуют широкий спектр разных антигенов. Еще одна группа лимфокинов способствует разрушению инфицированных клеток. Наконец, ряд лимфокинов стимулирует добавочное количество Т-клеток к делению, что обеспечивает быстрое возрастание числа клеток, которые отвечают на тот же антиген и выделяют еще больше лимфокинов.
Антитела, вырабатываемые В-клетками и поступающие в кровь и другие жидкости организма, относят к факторам гуморального иммунитета (от лат. humor – жидкость). Защита организма, осуществляемая с помощью Т-клеток, называется клеточным иммунитетом, так как в ее основе лежит взаимодействие отдельных клеток с антигенами. Т-клетки не только активируют другие клетки путем выделения лимфокинов, но и атакуют антигены с помощью содержащих антитела структур на поверхности клетки.
Антиген может индуцировать оба типа иммунного ответа. Более того, в организме происходит определенное взаимодействие между Т- и В-клетками, причем Т-клетки осуществляют контроль над В-клетками. Т-клетки могут подавлять B-клеточный ответ на безвредные для организма чужеродные вещества или, наоборот, побуждать В-клетки вырабатывать антитела в ответ на вредные вещества с антигенными свойствами. Повреждение или недостаточность данной контролирующей системы может проявляться в виде аллергических реакций на вещества, обычно безопасные для организма.
Этапы иммунной реакции
Иммунную реакцию от начала до завершения можно разделить на три этапа:
Распознавание антигена;
формирование эффекторов;
эффекторная часть иммунного ответа.
Основу теории специфического распознавания антигенов составляют следующие постулаты:
1. На поверхности лимфоцитов присутствуют специфические антигенсвязывающие рецепторы, которые экспрессируются вне зависимости от того, встречался ли ранее организм с данным антигеном.
2. Каждый лимфоцит имеет рецептор только одной специфичности.
3. Антигенсвязывающие рецепторы экспрессируются на поверхности как Т-, так и В-лимфоцитов.
4. Лимфоциты, наделенные рецепторами одной специфичности, являются потомками одной родительской клетки и составляют клон.
5. Макрофаги осуществляют презентацию антигена лимфоциту.
6. Распознавание «чужого» напрямую связано с распознаванием « своего », т.е. антигенсвязывающий рецептор лимфоцита распознает на поверхности макрофага комплекс, состоящий из чужеродного антигена и собственного антигена гистосовместимости (МНС).
В состав молекулярного аппарата антигенного распознавания входят антигены главного комплекса гистосовместимости, антигенсвязывающие рецепторы лимфоцитов, иммуноглобулины, молекулы клеточной адгезии.
К основным этапам антигенного распознавания относятся:
Неспецифический этап;
распознавание антигена Т-клетками;
распознавание антигена В-клетками;
клональная селекция.
Неспецифический этап
Макрофаг первым вступает во взаимодействие с антигеном, осуществляя филогенетически самую древнюю разновидность иммунной реакции. Антиген подвергается фагоцитозу и перевариванию, результатом которого является «разборка» крупных молекул на составные части. Этот процесс называется «процессингом антигена». Затем процессированный антиген экспрессируется в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости на поверхности макрофага.
Распознавание антигена Т- клетками. Т - хелпер распознает комплекс, состоящий из чужеродного антигена и собственного антигена МНС. Для иммунного ответа необходимо одновременное распознавание как чужеродного антигена, так и собственного антигена МНС.
Распознавание антигена В- клетками. В- лимфоциты распознают антигены посредством своих иммуноглобулиновых рецепторов. Антиген также может подвергаться повторному процессингу при взаимодействии с В-лимфоцитом. Процессированный антиген помещается на поверхность В- клетки, где он распознается активированным Т - хелпером. В- лимфоцит не способен к самостоятельному ответу на антигенную стимуляцию, поэтому ему необходимо получить второй сигнал от Т -хелпера. Антигены, иммунная реакция на которые возможна только с таким повторным сигналом, называются тимусзависимыми. Иногда активация В - лимфоцитов возможна и без участия Т - клеток. Бактериальный липополисахарид в высоких концентрациях вызывает активацию В - лимфоцитов. При этом специфичность иммуноглобулиновых рецепторов В - лимфоцита не имеет значения. В данном случае собственная митогенная активность липополисахарида исполняет роль второго сигнала для В - лимфоцитов. Такие антигены называют тимуснезависимыми антигенами типа I. Некоторые линейные антигены (полисахариды пневмококков, поливинилпирролидон и др.), также стимулируют В- клетки без участия Т - лимфоцитов. Эти антигены длительное время остаются на мембране специализированных макрофагов и называются тимуснезависимыми антигенами типа II.
Клональная селекция
При попадании в организм антигена происходит селекция клонов с рецепторами, комплементарными данному антигену. Только представители этих клонов участвуют в дальнейшей антигензависимой дифференцировке клона В-лимфоцитов.
Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов.
Взаимодействие между клетками в процессе формирования иммунного ответа на антигенную стимуляцию осуществляется за счет особых растворимых медиаторов - цитокинов. Под воздействием различных цитокинов, продуцируемых макрофагами либо Т-лимфоцитами, происходит созревание В-лимфоцитов в антителообразующие клетки.
Для В- лимфоцитов конечным этапом дифференцировки является преобразование в плазматическую клетку, которая продуцирует огромное количество антител. Специфичность этих антител соответствует специфичности иммуноглобулинового рецептора В- лимфоцита -предшественника.
После того, как эффекторное звено иммунной реакции сформировано, наступает ее третий этап. На завершающем этапе иммунного ответа задействованы антитела, система комплемента, а также цитотоксические Т-лимфоциты, осуществляющие цитотоксическую реакцию.
Комплекс микроорганизма с антителом запускает классический путь активации системы комплемента, в результате чего образуется мембраноатакующий комплекс (МАК), наносящий клеточной стенке бактерии повреждения. Кроме того антитела нейтрализуют бактериальные токсины и, связываясь с инкапсулированными бактериями, облегчают их фагоцитоз макрофагами. Этот феномен называется опсонизацией. Доказано, что неопсонизированным инкапсулированным бактериям часто удается избежать фагоцитоза.
Внешне же иммунный ответ проявляется в развитии острой воспалительной реакции.
Иммунные реакции
Под иммунитетом понимают систему защиты организма от всего генетически чужеродного — будь то микробы, трансплантаты (пересаженные ткани и органы) или изменившиеся в антигенном отношении собственные клетки, включая раковые или отжившие свой срок нормальные.
Прежде чем нейтрализовать, уничтожить и элиминировать (вывести) из организма носителей генетической чужеродности, их необходимо обнаружить и распознать. Все клетки индивидуального организма имеют специальную маркировку (антигены тканевой совместимости), благодаря которой они воспринимаются иммунной системой как «свои». Клетки, не имеющие такой маркировки, воспринимаются как «чужие», атакуются и уничтожаются иммунной системой. Чужеродные вещества и клетки, вызывающие специфический иммунный ответ, называются антигенами. Различают экзогенные антигены (белки, полисахариды, искусственные полимеры, вирусы, бактерии и их токсины, трансплантаты) и эндогенные антигены , к которым относятся собственные ткани организма, измененные повреждением, и мутантные клетки, постоянно появляющиеся в организме человека (в сутки образуется до 106 мутантных клеток). Таким образом, иммунная система защищает многоклеточный организм от вторжения извне и от «внутренней измены» и, тем самым, обеспечивает генетическое постоянство всех соматических клеток, составляющих конкретный индивидуальный организм.
Иммунный ответ осуществляется иммунокомпетентными клетками и продуктами их жизнедеятельности — медиаторами иммунных реакций. Различают Т- и В-системы иммунитета. Т-система обеспечивает преимущественно противоопухолевую, антивирусную защиту, а также реакции отторжения трансплантата. В-система обеспечивает, главным образом, гуморальную антибактериальную защиту и нейтрализацию токсинов. Т-система иммунитета представлена популяцией тимусзависимых лимфоцитов (Т-лимфоцитов), которые имеют разную специализацию:
¨ Т-киллеры (Тк) — клетки-убийцы генетически чужеродных клеток;
¨ Т-хелперы (Тх) — клетки-помощники — стимулируют посредством хелперных медиаторов образование клона антигенчувствительных Т-киллеров и В-лимфоцитов;
¨ Т-супрессоры (Тс) — клетки, подавляющие посредством супрессорных медиаторов иммунный ответ.
Совместная деятельность Тх- и Тс-лимфоцитов определяет направленность, силу и продолжительность иммунного ответа. В начальный период нормального иммунного ответа превалирует активность Т-хелперов, в момент окончания — Т-супрессоров. Активность иммунокомпетентных клеток находится под контролем специальных генов иммунного ответа — Ir-генов. В частности, Ir-гены контролируют синтез антител и медиаторов иммунитета (хелперных и супрессорных).
В-система представлена популяцией В-лимфоцитов, которые, в ответ на антиген (антигенную стимуляцию), трансформируются в плазмоциты, — клетки, синтезирующие антитела (иммуноглобулины) (рис. 8.1). Фагоциты осуществляют фагоцитоз (рис. 8.2).
Рис. 8.1. Этапы формирования приобретённого иммунитета:
I — взаимодействие Т- и В-лимфоцитов с участием макрофага;
II — формирование клеток, хранящих информацию об антигенной структуре конкретного микроорганизма и способных вырабатывать специфические белки, связывающие микроорганизмы (антитела)
Рис. 8.2. Стадии фагоцитоза:
I — сближение фагоцита с объектом (комплексом антиген-антитело);
II — прилипание (адгезия) — способствуют опсонины;
III — захват фагоцитируемого объекта;
IV — переваривание комплекса антиген-антитело
Известны пять классов иммуноглобулинов: IgМ, IgG, IgА, IgE и IgD, которые продуцируются в строго определенной последовательности. IgM — низкоспецифичные антитела, которые вырабатываются первыми в ответ на антиген. Они образуют непрочную связь с антигеном и мобилизуют плазмоциты на продукцию высокоспецифичных антител (IgG и IgA). Смена синтеза IgM на синтез IgG и IgA происходит под влиянием лимфокинов (медиаторов), секретируемых Т-хелперами. IgG находятся в сыворотке крови и называются сывороточными антителами . Они прочно связывают антиген и являются самыми распространенными антителами против антигенной угрозы. IgA секретируются слизистыми оболочками носа, дыхательных путей, кишечника, урогенитальной системы. Они называются секреторными антителами и выполняют роль «первой линии обороны» в местах внедрения антигена. У млекопитающих они передаются от матери к ребенку через грудное молоко. IgE (реагины) синтезируются преимущественно в лимфоидной ткани слизистых оболочек и лимфатических узлах кишечника и бронхов. Они обладают высокой гомоцитотропностью (сродством к клеткам собственного организма) и поэтому могут выступать в качестве соучастников аллергических реакций. Роль IgD пока не установлена.
Действие иммуноглобулинов на антигены проявляется в следующих вариантах:
1. Агглютинация (склеивание) и иммунный лизис — растворение бактериальных антигенов.
Иммунный ответ
Такие иммуноглобулины называются агглютининами и бактериолизинами. Реакции иммунного лизиса происходят при участии комплемента — составной части кровяной сыворотки.
2. Цитотоксическое действие антител (цитотоксинов) — лишение клеток жизнеспособности. Эта реакция также протекает при участии комплемента.
3. Нейтрализация токсинов антителами (антитоксинами).
4. Опсонизация — усиление антителами (опсонинами) фагоцитарной активности микро- и макрофагов.
5. Преципитация — осаждение антигенов антителами.
Полноценный иммунный ответ обеспечивается кооперативным взаимодействием Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и макрофагов. Включение иммунных механизмов защиты начинается с момента проникновения антигена в организм. Макрофаг (моноцит) захватывает антиген, перерабатывает и выводит его антигенные детерминанты (структуры, обусловливающие антигенную уникальность и чужеродность) на свою клеточную поверхность. Обработанный таким образом антиген в 100-1000 раз более иммуногенен, чем нативный антиген. Он включает дальнейшие иммунные механизмы. Антигенные детерминанты, представленные макрофагом, распознаются В-лимфоцитами и Тх-клетками.
При экзогенной антигенной стимуляции В-лимфоциты трансформируются в плазмоциты и начинают сразу же продуцировать низкоспецифичные IgM. Через некоторое время, под влиянием медиаторов Т-хелперов, плазмоциты переключают синтез иммуноглобулинов на высокоспецифичные к данному антигену IgG, а затем — IgA. Одновременно Тх-лимфоциты стимулируют образование клона В- лимфоцитов, в которых формируется иммунная память на данный антиген. Таким способом обеспечивается активный иммунитет .
Тх-лимфоциты стимулируют положительный хемотаксис нейтрофильных лейкоцитов (микрофагов) к месту расположения антигена, что является важным механизмом в обезвреживании бактерий.
Эндогенная антигенная стимуляция вовлекает в иммунный ответ Тк-лимфоциты. В результате кооперации макрофага, Т-хелпера и Т-киллера, последний приобретает свойства размножаться, создавая популяцию антигенчувствительных Тк-клеток, и целенаправленно уничтожать антигены. Помимо Тк-клеток цитотоксические эффекты осуществляются Нк-лимфоцитами (натуральными киллерами), которые уничтожают клеточные антигены (клетки-мишени) без предварительной кооперации (рис. 8.3).
Полноценный иммунный ответ редко осуществляется без взаимодействия его клеточного и гуморального вариантов. Так, Т-киллеры становятся антигенчувствительными, когда связываются со специфическими иммуноглобулинами, комплементарными антигенам клеток-мишений. Макрофаги, опсонизированные иммуноглобулинами, приобретают способность направленно атаковать клетки- мишени и растворять их.
Указанные механизмы иммунного ответа лежат также в основе аллергических реакций.
Предыдущая16171819202122232425262728293031Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Иммунные клетки и иммуноглобулины
Вместе с тем иммунная реакция может происходить по разным сценариям. Вначале иммунная система блокирует деятельность чужеродных объектов (иммуногенов), создавая особые химически реактивные молекулы (иммуноглобулины), ингибирующие деятельность иммуногенов.
Иммуноглобулины создаются лимфоцитами, которые являются основными клетками иммунной системы. Существует два основных вида лимфоцитов, при совместной активности создающих все виды иммунных реакций: T-лимфоциты (T-клетки) и B-лимфоциты (B-клетки). T-лимфоциты при восприятии чужеродного материала сами осуществляют иммунный ответ – уничтожают генетически чужеродные клетки. T-лимфоциты – это основа клеточного иммунитета.
Гуморальный иммунитет
B-лимфоциты нейтрализуют чужеродные объекты дистанционно, создавая особые химически реактивные молекулы – антитела. B-лимфоциты – это основа гуморального иммунитета.
Существует пять классов антител: IgM, IgD, IgE, IgG, IgA. Основным классом иммуноглобулинов ялвятеся IgG.
Что такое иммунная реакция или иммунный ответ?
Антитела IgG составляют около 70% от всех антител. Иммуноглобулины IgA составляют около 20% всех антител. Антитела остальных классов составляют всего 10% от всех антител.
Когда происходит гуморальная иммунная реакция, уничтожение чужеродного материала происходит в плазме крови в виде химической реакции. Иммуноглобулины, созданные вследствие иммунной реакции, могут оставаться на многие годы и десятилетия, обеспечивая организм защитой от повторного заражения, например свинкой, ветрянкой, краснухой. Благодаря этому процессу возможна вакцинация.
T-клетки отвечают за иммунный ответ на двух уровнях. На первом уровне они способствуют обнаружению чужеродного материала (иммуногена) и активируют B-клетки к синтезу иммуноглобулинов. На втором уровне, после стимуляции B-клеток к выработке иммуноглобулинов, T-клетки начинают расщеплять и разрушать чужеродный материал напрямую.
Такая активированная T-клетка уничтожает вредоносную клетку, сталкиваясь и прикрепляясь к ней вплотную – поэтому их стали называть клетками-убийцами или T-киллерами.
Клеточный иммунитет
Клеточная иммунная защита была открыта И.И. Мечниковым в конце XIX века. Он доказал, что защита организма от заражения микроорганизмами происходит благодаря способности особых клеток крови прикрепляться и расщеплять вредоносные микроорганизмы.
Этот процесс назвали фагоцитозом, а клеток-убийц, выслеживающих чужеродные микроорганизмы – фагоцитами. Синтез иммуноглобулинов и процесс фагоцитоза являются специфическими факторами иммунитета человека.
Неспецифический иммунитет
Помимо специфических, имеются неспецифические факторы иммунитета. Среди них:
непропускание возбудителей инфекции эпителием;
присутствие в кожных выделениях и желудочном соке веществ, негативно воздействующих на инфекционные агенты;
наличие в плазме крови, слюне, слезах и т.д. особых энзимных систем, расщепляющих бактерий и вирусов (например, мурамидаза).
Защита организма осуществляется не только разрушением внедряющегося в него генетически чужеродного материала, но и выведением из органов и тканей уже локализовавшихся в них иммуногенов. Известно, что вирусы, бактерии и отходы их жизнедеятельности, а также погибшие бактерии транспортируются наружу через потовые железы, мочевыделительную систему и кишечник.
Еще одним неспецифическим механизмом защиты служит интерферон – антивирусная белковая структура, синтезируемая инфицированной клеткой. Перемещаясь по внеклеточному матриксу и попадая в здоровые клетки, этот белок защищает клетку от вируса и от системы комплемента – комплекса белков, постоянно присутствующих в плазме крови и других жидкостях организма, которые уничтожают клетки, содержащие чужеродный материал.
Защита организма ослабевает чаще всего из-за несоблюдения здорового образа жизни или вследствие злоупотребления антибиотиками.
Перед применением необходимо проконсультироваться со специалистом.
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum —сыворотка и logos — учение),т.е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни.
Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др,
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т,е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
Реакция агглютинации: Реакция агглютинации (от лат. oggiutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37).
Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.
1. Определение возбудителя, выделенного от больного
Ориентировочная реакция агглютинации нз стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.
Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного.
К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного
2.Определение антител в сыворотке крови больного:
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие Q-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
— Агглютинация с Н-диогностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного зритроциторного диагностиками, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами
Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови,что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки ввиде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.
Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикам — эритроциты, на которых адсорбированы антитела, Например, можно обнаружить ботупиничес- кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА).
Реакция Кумбса Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют анти глобул и новую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов
С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.
Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов.
Реакция торможения гемагглютинации Гемагглютинины вирусов склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки РТГА. Реакция торможения гемагглютинации основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антитепами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Реакция преципитации Реакция преципитации (от лат. praecipito — осаждать) — это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
Реакция кольцепреципитации , Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов об- эазуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).
Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофорезавносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат, floccus — хлопья шерсти} — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин—антитоксин или анатоксин—антитоксин, Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Штаммы возбудителя дифтерии — С, cliphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенны- МИ, Образование экзотоксина зависит от наличия в бактерияхпрофага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре.
Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорято нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.
Реакция связывания комплемента Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным
РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).
Реакция иммунофлюоресценции Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс- диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лу- чах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
IT. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65).
Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.
Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИЧ>А или РИА). Иммуноблоттинг ислользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ. blot — пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА, Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного B). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом C). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген 4- антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата D), изменяющего окраску под действием фермента.
Полимеразная цепная реакция: основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких од- нонитевых ДНК, комплементарных З"-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.
Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.
Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .
Антигены бывают 2-х видов:
1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);
2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).
При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .
Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:
1 реакции клеточного типа ;
2. реакции гуморального типа .
Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.
Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.
Для заметок:
Классификация иммунокомпетентных клеток
Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:
1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);
2. Эффекторные клетки;
3. Вспомогательные клетки;
4. Регуляторные клетки;
5. Клетки иммунологической памяти.
Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.
Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.
Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);
Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.
Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.
Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .
Для заметок:
В-лимфоцитопоэз
Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:
СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)
Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.
Т-лимфоцитопоэз
(Антигеннезависимая дифференцировка)
Происходит по схеме:
СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)
Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.
Иммунологическая реакция гуморального типа
Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).
I фаза
(Стадия распознавания антигена)
1. Эндоцитоз антигена АПК;
2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.
3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;
4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;
5. Секреция АПК интерлейкина 1.
Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.
Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36
Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа
II фаза
Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.
III фаза
Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.
Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.
Для заметок:
Иммунологическая реакция клеточного типа
I фаза
(Стадия распознавание антигена)
В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.
При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.
II фаза
(Активация Т-лимфоцитов)
Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:
1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.
2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37
Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.
Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа
III фаза
(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)
1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;
2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;
3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;
Иммунодиагностика
Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.
Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.
Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.
Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.
Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.
К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.
Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
протекающие in vivo . воспроизводимые in vitro
(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)
гуморальные клеточные серологические клеточные
В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).
Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .
Таблица № 15.
Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro
|
Феномены иммунодиагностических реакций |
|||||
|
Агглютинации |
Потребления комплемента |
Иммунофлюо-ресценции |
Преципитации |
Нейтрализации |
Иммуноконъю- гации |
|
группы иммунодиагностических реакций |
|||||
|
а. прямые б. непрямые в.торможения г. сорбции |
б. непрямые в. торможения |
б.непрямые в.торможения |
а. осадочные б. диффузионные |
а. гашения действия б.нейтрализа-ции |
а. прямые б.непрямые в. торможение |
Иммунологические феномены
Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.
К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.
К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.
К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.
К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).
Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента
К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).
К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).
К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).
К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).
Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.
К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.
К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).
К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).
Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).
К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).
Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.
Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.
Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.
Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.
Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.
По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.
К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.
К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.
В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).
Разновидности иммунологических реакций
В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).
Феномен агглютинации
Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).
Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:
1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.
2. Известную 2 % бактериальную взвесь.
3. Исследуемую сыворотку.
Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.
Исследуемая культура.
Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.
1. Развернутый вариант РА.
В настоящее время реакция не применяется.
2. Капельный вариант РА .
Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.
Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.
Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.
Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.
При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.
Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.
Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.
Диагностикумы
иммуноглобулиновые антительные антигенные
белковые небелковые
Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.
1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.
Для постановки реакции необходимо иметь:
1. Диагностический препарат.
2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.
3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.
4. Инактиватор для исследуемых сывороток.
Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.
Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).
Макровариант.
Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.
1 этап . Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.
2 этап . Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).
Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.
Таблица № 17.
Схема постановки развернутого варианта РНГА
|
Ингредиенты |
Номера лунок и количество ингредиентов, в мл |
|||||||||
|
Исследуемая сыворотка, 1:50 | ||||||||||
|
Растворитель | ||||||||||
|
Полученные разведения | ||||||||||
|
АЭД, 5 % взвесь | ||||||||||
|
Результат РНГА | ||||||||||
|
Титр РНГА |
Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200 |
|||||||||
В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).
Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:
1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".
2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.
3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.
4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.
Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.
С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.
Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.
Реакция Ко-агглютинации (РКоА).
Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.
Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.
К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.
На предметное стекло наносят две капли: первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.
Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.
РТГА - реакция торможения гемагглютинации.
Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.
РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.
Реакция не применяется.
РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).
Метод выполняют в 4 этапа.
1 этап . Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.
2 этап . Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.
3 этап . Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.
4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).
В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.
Таблица № 18.
Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1
|
Ингредиенты |
Номера лунок и количество ингредиентов, мл |
||||||
|
Известная сыворотка 1:100 | |||||||
|
Растворитель | |||||||
|
Полученные разведения | |||||||
|
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре |
|||||||
|
Результат РНГА | |||||||
|
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки |
Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600): 3 = 1:533 . |
||||||
В XVIII в. многие люди, будучи уверены, что когда-нибудь в жизни они все равно зара-зятся оспой, намеренно подвергали себя возможности заражения, для того чтобы переболеть этой болезнью в более благоприятных условиях и в дальнейшем не опасаться ее. Даже и теперь некоторые родители из тех же соображений не предохраняют своих детей от заражения детскими болезнями, зная, что некоторыми болезнями люди болеют лишь один раз в жизни. Этот тип устойчивости называется приобретенным иммунитетом. Но человек, невосприимчивый к оспе в результате перенесения этой болезни, обладает такой же восприимчивостью к кори или к любой другой болезни, как и тот, кто никогда не болел оспой; поэтому мы говорим, что иммунитет специфичен.
Активно приобретенный иммунитет обусловлен образованием в организме специфических белков, так называемых антител, которые выделяются в кровь и в тканевые жидкости после проникновения в организм какого-либо чужеродного белка, называемого антигеном. Антиген и антитело реагируют друг с другом, и это предохраняет организм от повреждения. Если, например, впрыснуть кролику яичный альбумин (белковое вещество), то клетки животного отвечают выработкой антител, специфичных по отношению к этому альбумину. Кроме того, организм способен вырабатывать особый род антител, называемый антитоксином, в ответ на присутствие токсина (обычно белка), выделяемого бактерией. После того как образовалось достаточное количество антитоксина, данный токсин уже не может причинить вреда организму.
Уже несколько десятков лет назад было известно, что антитела, образующиеся в ответ на введение данного антигена, не всегда однородны - они могут различаться по своей специфичности, по степени активности в отношении реакции с антигеном и по физико-химическим свойствам, (величине и форме молекулы, ее суммарному заряду и последовательности аминокислот).
Антитела, циркулирующие в крови, связаны с определенной фракцией плазмы - гамма-глобулинами. Гамма-глобулины - белки, очень сходные по своим физическим и химическим свойствам, но различающиеся по специфичности в отношении антигенов. Различия между разными антителами совершенно неуловимы; они даже еще более тонкие, чем различия между разными ферментами. По-видимому, лишь небольшая часть белковой молекулы (имеющая молекулярный вес порядка 160 000) иммуноло-гически активна. Различия между разными
антителами, по-видимому, сводятся к незначительным различиям в форме молекулы бедка, в расположении составляющих ее атомов, обеспечивающем комплементарность геометрических конфигураций антигена и антитела, которые должны подходить друг к другу, как ключ и замок.
Лимфатические ткани обычно синтезируют антитела только к «чужеродным» белкам, т. е. к белкам, которые при нормальных условиях не содержатся в организме. Но иногда некоторые нормальные компоненты тела могут обладать антигенным действием и вызывать обра-
зование антител; в результате возникающей при этом реакции антиген-антитело человек может заболеть.
После инъекции антигена наступает латентный период, продолжающийся примерно неделю, а затем в крови появляются антитела. Титр антител медленно повышается, достигает невысокого пика (первичная реакция) и вновь снижается. Вторичная инъекция антигена через несколько дней, недель или даже месяцев вызывает быстрое образование антител после более короткого латентного периода (вторичная реакция). Титр антител достигает более высокого уровня и снижается медленнее. Последующие инъекции антигена вызывают дополнительные вторичные реакции, до тех пор пока не будет достигнут максимальный титр. Со временем этот титр обычно снижается, и периодическая peiиммунизация помогает поддерживать иммунитет на удовлетворительном уровне. У предварительно иммунизированного человека вторичную реакцию можно также вызвать, заразив его естественным инфекционным агентом; антитела при этом обычно образуются достаточно быстро и предотвращают появление симптомов заболевания.
Механизм образования специфических антител под действием антигена неизвестен. Известно только, что антитела синтезируются заново из аминокислот, а не просто образуются путем изменения пространственной конформа-ции предсуществующей полипептидной цепи. Синтез этих специфических белков происходит, вероятно, так же, как и обычный синтез белков в рибосомах клетки, т. е. под контролем рибонуклеиновокислотных матриц (см. разд. 342). Антиген, по-видимому, входит в плаз-моциты и другие «иммунологически компетент-ные» клетки и вызывает образование специфической нуклеиновой кислоты-матрицы, которая в свою очередь определяет образование специфического антитела. Возможно, что информацию, необходимую для синтеза специфических антител, доставляет сам антиген или же она постоянно присутствует в клетке, будучи заключена в генах, но может быть использована только в присутствии специфического антигена. Высказывалось также мнение, что проникновение в клетку антигена ведет к проявлению генетически обусловленной способности к синтезу специфического антитела, находившейся до того в скрытом состоянии. Эта последняя теория дает наилучшее объяснение экспериментальным фактам, известным в настоящее время, и больше соответствует общей теории регуляции синтеза белков. Когда плаз-моциты, образующие специфическое антитело, делятся, обе дочерние клетки сохраняют способность вырабатывать такие же антитела, и эта информация передается на протяжении многих поколений клеток.
Антитела реагируют с антигеном одним или несколькими различными способами. Они могут соединяться с токсином, нейтрализуя его ядовитые свойства; они могут растворять клетки бактерий; наконец, они могут сенсибилизировать бактерии - делать их более уязвимыми для лейкоцитов. Некоторые антитела агглютинируют микробы тем самым препятствуя их распространению и еще вернее обеспечивая их задержку в лимфатических узлах.
Антитела метят, присоединяя к ним флуоресцирующий краситель, после чего их можно выявлять в специфических участках тканей с помощью микроскопа. Этот метод, разработанный в 1941 г. Кунсом, позволил проводить разнообразные исследования с определением локализации в клетке специфических реакций между антигеном и антителом; он используется также в диагностике инфекционных болезней.
Другой способ приобретения иммунитета состоит в прививке при помощи вакцины. Вакцина - это специально производимый в больших количествах антиген, характерный для определенной болезни, достаточно сильный, чтобы стимулировать образование антител в организме, но не настолько сильный, чтобы вызвать самую болезнь. Токсичность антигена понижают различными способами. Некоторые вакцины содержат лишь небольшое количество токсина. Другие представляют собой комбинацию токсина с антитоксином: в то время как
антиген заставляет организм вырабатывать больше антител, антитела самой вакцины защищают клетки от повреждения. Некоторые токсины подвергают тепловой или химической обработке, уничтожающей их вредные свойства, но сохраняющей их способность стимулировать образование антител; такого рода вакцина называется анатоксином. Еще один метод состоит в ослаблении культур бактерий путем длительного выращивания их в пробирках, где они в конце концов утрачивают часть своей токсичности. Антирабическую вакцину (вакцина против бешенства) ослабляют высушиванием, другие вакцины - последовательной прививкой их ряду лабораторных животных. Брюшнотифозную вакцину можно приготовить из убитых бактерий брюшного тифа.
Метод вакцинации был открыт в конце XVIII в. английским врачом Э. Дженнером, который заметил, что работники, имевшие дело с коровами, больными коровьей оспой, никогда не заболевали настоящей оспой. Когда он попробовал втереть немного жидкости, взятой из оспенных пузырьков на коровьем вымени, в царапину на коже человека, то возникло легкое заболевание с появлением одной локализованной оспины в месте втирания. Вакцинированные таким способом люди никогда не заболевали оспой. Коровью оспу и настоящую оспу вызывают два различных, но близкородственных вируса; прививка вируса коровьей оспы вызывает образование антител, способных реагировать также и с близкородственным ему вирусом оспы человека. Теоретически представляется возможным создавать путем прививок иммунитет против всех болезней, но для многих важных заболеваний, в том числе для туберкулеза, гриппа и сифилиса, способы вакцинации еще не разработаны.
Часто случается, что организм не способен достаточно быстро вырабатывать антитела для борьбы с антигенами микроба. В таких случаях производят инъекции антител какого-нибудь животного (обычно лошади), чтобы снабдить ими организм до того времени, когда он сам сможет вырабатывать их в достаточном для защиты количестве. Впрыскивание препарата антител (называемого сывороткой)- это единственный способ получения пассивного иммунитета; хотя такой иммунитет оказывает немедленное действие, он полностью исчезает спустя несколько недель.
Для приготовления сыворотки бактерий выращивают в пробирках до тех пор, пока не образуется большое количество токсина. Затем
этот токсин впрыскивают в возрастающих дозах лошади, и организм животного постепенно вырабатывает огромное количество антитоксина, который накапливается в крови. После этого у лошади время от времени берут кровь, удаляют из нее эритроциты и концентрируют антитоксин.
Естественный иммунитет. У всех животных и растений невосприимчивость к определенным болезням является наследственным свойством, и ее не приходится приобретать. Есть данные, указывающие на то, что различные расы человека наследственно различаются между собой по устойчивости к таким болезням, как туберкулез, дифтерия и грипп. Наследственная невосприимчивость к болезням, называемая естественным иммунитетом, передается из поколения в поколение.
Один из типов естественного иммунитета - это невосприимчивость, выработавшаяся в популяции, которая соприкасалась с возбудителем определенной болезни на протяжении многих поколений. Многие болезни (например, корь), в наши дни сравнительно легко протекающие
у европейцев, чрезвычайно тяжело протекали у американских индейцев и у жителей островов южной части Тихого океана, когда они впервые распространились среди этих народов. Сифилис тоже в настоящее время представляет собой гораздо более легкое заболевание, чем во времена первого появления его в Европе, когда он нередко в первый же месяц приводил к смерти. Многие тропические болезни, например малярия и сонная болезнь, у иностранцев протекают тяжелее, чем у местного населения. Другие болезни, первоначально весьма распространенные, со временем стали редкими: например, проказа чрезвычайно часто встречалась в библейские времена.
Эти изменения к лучшему обычно истолковывают как результат постепенного «естественного отбора»: люди, перенесшие в далекие времена данную болезнь, передавали свою «стойкость» своим потомкам и так далее. Возможно также, что в некоторых случаях адаптировались и сами микроорганизмы, что сопровождалось понижением их вирулентности.
Нормальный вирус или вирус, убитый слабым нагреванием или действием ультрафиолетового света, может препятствовать росту других вирусов в организме хозяина. Этим можно было бы объяснить малое распространение таких заболеваний, как полиомиелит, в областях, где эндемичны другие кишечные вирусы. Присутствие этих вирусов препятствует росту вируса полиомиелита; однако их действие состоит не в том, что они вызывают образование антител, а в том, что они побуждают клетки хозяина вырабатывать вещество, называемое интерфероном. Это вещество удалось выделить; оно представляет собой белок с молекулярным весом около 63 000.
Это недавно открытое явление служит, возможно, другим важным фактором защиты организма от болезней. Антитела имеют особенно важное значение в создании иммунитета к повторному заражению данным возбудителем; интерферон же, вероятно, играет важную роль в защите при первом заражении вирусом.
Исследователи доказали, что интерферон образуется в ответ на вирусную инфекцию; концентрация его достигает максимума на 3- 5-й день после заражения, тогда как антитела к инфекционному агенту появляются гораздо позднее - не ранее 8-го дня.
Интерферон действует не прямо на вирус, а на клетку-хозяина. Вирус проникает в клетки, обработанные интерфероном, но не способен размножаться в них. Интерферон, по-видимому, уменьшает количество АТФ, которое может быть использовано для размножения вируса, возможно путем разобщения процессов фосфо-рилирования и окисления (см. разд. 57). Имеющиеся данные позволяют предполагать, что существует интерферон только одного типа и что он эффективен против самых различных вирусов. Ссылки по теме
